免疫學(xué)方法診斷結(jié)核病的研究進(jìn)展

史玲莉（綜述），閆冀煥（審校）

（河北省出入境檢驗(yàn)檢疫局保健中心檢驗(yàn)科，河北石家莊 050000）

免疫學(xué)方法診斷結(jié)核病的研究進(jìn)展

史玲莉（綜述），閆冀煥（審校）

（河北省出入境檢驗(yàn)檢疫局保健中心檢驗(yàn)科，河北石家莊 050000）

結(jié)核；免疫學(xué)試驗(yàn)；診斷；綜述文獻(xiàn)

結(jié)核病是當(dāng)今世界由單一致病菌引起的病死率最高的疾病。我國(guó)有130萬人感染結(jié)核，其中有約11.2萬人為耐多藥，僅次于印度的患病和耐多藥人數(shù)［1］。目前臨床上對(duì)結(jié)核病的診斷主要以接觸史、癥狀體征、結(jié)核菌素皮試、影像學(xué)、分泌物培養(yǎng)、抗酸染色等作為臨床確診或排除的標(biāo)準(zhǔn)，存在漏檢率高、與其他疾病難于區(qū)分等問題。因此，利用可靠、快捷、簡(jiǎn)便的免疫學(xué)檢測(cè)方法來加強(qiáng)結(jié)核病的診斷和防控，已經(jīng)成為共識(shí)。本文就臨床上常用的結(jié)核免疫檢測(cè)試劑的原理、應(yīng)用效果和研究進(jìn)展進(jìn)行了比較和闡述，并對(duì)免疫學(xué)檢測(cè)的影響因素進(jìn)行分析。

1 結(jié)核菌素試驗(yàn)

結(jié)核菌素試驗(yàn)是常用的結(jié)核診斷和輔助診斷方法，其原理是Ⅳ型超敏反應(yīng)，目前有4種結(jié)核菌素，即舊結(jié)核菌素、純化蛋白衍生物（purified protein derivative，PPD）、卡介苗結(jié)素和非結(jié)核分枝桿菌結(jié)素。

1.1 利用PPD檢測(cè)：PPD是一種粗糙未明確成分的結(jié)核分枝桿菌抗原的混合物，PPD試驗(yàn)是將結(jié)核菌和結(jié)核蛋白作為抗原注入人體內(nèi)來測(cè)定機(jī)體對(duì)結(jié)核桿菌是否能引起變態(tài)反應(yīng)的一種皮膚試驗(yàn)。外周血的CD4+T淋巴細(xì)胞與腫瘤壞死因子γ（tumor necrosis factor alpha，TNF-γ）及白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）均參與了結(jié)核菌感染的免疫病理過程。PPD注入皮內(nèi)后與已感染結(jié)核菌人體的特異免疫細(xì)胞相互作用，釋放一系列淋巴因子，使巨噬細(xì)胞活化，產(chǎn)生免疫變態(tài)反應(yīng)，導(dǎo)致注射局部產(chǎn)生紅腫硬結(jié)，硬結(jié)大小與反應(yīng)的強(qiáng)度和結(jié)核菌感染的程度呈正比。

國(guó)內(nèi)有試劑盒廠家將PPD作為靶抗原制備成ELISA檢測(cè)試劑盒（如伊利康酶免試劑盒），但由于其成分復(fù)雜，不可避免會(huì)存在假陽(yáng)性的問題。張民軍等［2］對(duì)脂阿拉伯甘露糖、分泌性蛋白抗原、純化卡介苗蛋白和人型PPD抗原進(jìn)行比較后，證實(shí)PPDIgG是4種靶特異結(jié)核抗體中特異性最低的。但作為最早運(yùn)用于血清學(xué)試驗(yàn)的靶抗原，PPD抗原制備技術(shù)完善，成本低廉，因此在國(guó)產(chǎn)結(jié)核抗體試驗(yàn)盒中得到了廣泛采用。

除了不同廠家PPD純度的不同會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果外，機(jī)體的變態(tài)反應(yīng)、病情輕重也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，而且曾經(jīng)被結(jié)核分枝桿菌感染而治愈的人群也會(huì)出現(xiàn)陽(yáng)性表現(xiàn)，加上其測(cè)量為人為測(cè)量，測(cè)量方法以及方式等不同也造成一定的人為誤差，而且由于其受卡介苗以及免疫抑制劑的干擾，也可造成假陽(yáng)性的存在。變態(tài)反應(yīng)前期，PPD試驗(yàn)可為陰性；應(yīng)用糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑者、營(yíng)養(yǎng)不良以及麻疹、百日咳患者，結(jié)核菌素反應(yīng)可暫時(shí)消失；PPD試驗(yàn)反應(yīng)強(qiáng)度與外周血淋巴細(xì)胞減少相關(guān)，老年人免疫功能受損或存在免疫抑制現(xiàn)象，嚴(yán)重結(jié)核病和各種危重患者，導(dǎo)致部分活動(dòng)性結(jié)核也可表現(xiàn)為陰性。Jackson-Sillah等［3］對(duì)肺結(jié)核患者運(yùn)用結(jié)核抗體檢查的研究中發(fā)現(xiàn)，22％患者出現(xiàn)假陰性，其中有近2/3患者為61～83歲的老年患者，試驗(yàn)組有34例患者出現(xiàn)結(jié)核抗體假陰性，其中33例患者為老年患者；這部分老年患者的免疫系統(tǒng)較陽(yáng)性患者更差，體液免疫和細(xì)胞免疫功能都很低。張曉希等［4］研究結(jié)果，在老年肺結(jié)核菌陽(yáng)患者中陽(yáng)性率為66％，特異度為50％。

因此，在排除以上影響因素的情況下，PPD試驗(yàn)陰性，常規(guī)可排除結(jié)核感染。PPD實(shí)驗(yàn)的強(qiáng)陽(yáng)性結(jié)果有絕對(duì)的診斷意義，此時(shí)血中結(jié)核抗體的陽(yáng)性率在結(jié)核病患者中也相當(dāng)高。PPD試驗(yàn)陽(yáng)性，提示結(jié)核菌感染，需結(jié)合臨床表現(xiàn)、痰液細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)和X線檢查等進(jìn)行分析，進(jìn)一步確診或排除。

1.2 利用BCG蛋白檢測(cè)：目前使用該抗原作為包被抗原的試劑盒主要是法國(guó)VEDA LAB公司出品的TB-CHECK-1試劑盒，該試劑盒采用一步免疫層析法，采用有色標(biāo)記的抗人免疫球蛋白來特異性地檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌抗體，若樣本中含有抗BCG抗體，可先與有色物標(biāo)記的抗人免疫球蛋白結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，該復(fù)合物再與固定于陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)（T）處的BCG蛋白結(jié)合，產(chǎn)生一條玫瑰色線條。若樣本中沒有抗結(jié)核抗體，反應(yīng)混合物經(jīng)T流向質(zhì)控區(qū)（C），在C區(qū)形成一條玫瑰色線條，表明試劑有效。該試劑主要檢測(cè)IgG和IgA抗體，高濃度的IgM抗體也可被檢出。而接種過疫苗的人體試驗(yàn)不起反應(yīng)。根據(jù)試劑盒說明書，其整體靈敏度為86％（133/154），而特異度為92.8％（220/237），痰涂陽(yáng)性患者靈敏度為86％（129/150），痰涂陰性患者靈敏度為78％（18/23）對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的靈敏度為87％（113/130），對(duì)活動(dòng)性非結(jié)核分枝桿菌靈敏度為83％（20/24）。周衛(wèi)敏等［5］采用此方法對(duì)431例肺結(jié)核患者進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為47.10％，其中菌陽(yáng)肺結(jié)核185例，陽(yáng)性率為51.35％，菌陰肺結(jié)核246例，陽(yáng)性率為43.90％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于說明書的靈敏度。這可能與國(guó)內(nèi)人群普遍接種BCG疫苗有關(guān)。

2 基于細(xì)胞免疫為主的試驗(yàn)

2.1 γ干擾素釋放試驗(yàn)（interferon gamma release assays，IGRAs）：IGRAs的原理即首次感染結(jié)核桿菌后產(chǎn)生的記憶T淋巴細(xì)胞將在人體內(nèi)長(zhǎng)期存在，當(dāng)再次受到結(jié)核桿菌相關(guān)抗原刺激后，這些記憶T淋巴細(xì)胞迅速增殖成為效應(yīng)T淋巴細(xì)胞。這些效應(yīng)T淋巴細(xì)胞分泌γ干擾素和其他一些細(xì)胞因子來刺激T淋巴細(xì)胞增殖并可以激活巨噬細(xì)胞。由于這個(gè)過程是針對(duì)特異結(jié)核分枝桿菌免疫原得到反應(yīng)，因此可以通過測(cè)定T細(xì)胞γ干擾素釋放反應(yīng)來檢查患者是否受到結(jié)核分枝桿菌感染。IGRAs的結(jié)果通過檢測(cè)代表結(jié)核分枝桿菌的抗原反應(yīng)后釋放γ干擾素的量來判斷。由于IGRAs技術(shù)使用的抗原是結(jié)核分枝桿菌RD1和RD16區(qū)編碼的蛋白，這些蛋白在卡介苗中缺失，所以IGRAs能夠較好地區(qū)別BCG接種和結(jié)核分枝桿菌感染，從而使IGRAs可以用于檢測(cè)結(jié)核感染。

2005年，美國(guó)CDC批準(zhǔn)使用QFT-G方法干擾素定量金標(biāo)試驗(yàn)（QuantiFERON Gold Test）檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染，2010年美國(guó)FDA又批準(zhǔn)了2種新的IGRAs方法輔助診斷潛伏結(jié)核分枝桿菌感染和活動(dòng)性結(jié)核病的方法，包括QFT-GIT（QuantiFERON-TB Gold In-tube test）和T細(xì)胞斑點(diǎn)檢測(cè)結(jié)核試驗(yàn)SPOT試驗(yàn)（the T-SPOT.TB test）。目前該方法已經(jīng)列入美國(guó)、歐洲等地結(jié)核病診療指南，以協(xié)助診斷結(jié)核感染的存在。QFT-G和QFT-GIT由澳大利亞Cellestis公司開發(fā)研制，利用全血作為樣本，用酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測(cè)早期分泌靶抗原6（early secreted antigenic target 6，ESAT-6）、培養(yǎng)分泌蛋白（culture filtrate protein 10，CFP10）和TB7 3種抗原刺激γ干擾素的釋放。而T-SPOT則是由英國(guó)Oxford Immunotec公司開發(fā)的使用外周血單核細(xì)胞來完成檢測(cè)的，利用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)檢測(cè)ESAT-6和CFP10 2種抗原刺激γ干擾素的釋放。有研究［6-7］顯示，在活動(dòng)性肺結(jié)核培養(yǎng)陽(yáng)性的病例中，QFT-GIT的靈敏度為81％，特異度為99％，而T-SPOT的總靈敏度為91％，總特異度為86％。國(guó)內(nèi)使用較多的是英國(guó)Oxford Immunotec公司生產(chǎn)的T-SPOT試劑，靈敏度和特異度與國(guó)外有較好的一致性。陳奎霖［8］對(duì)295例肺結(jié)核進(jìn)行T-SPOT檢測(cè)，陽(yáng)性率為82.0％，85例健康人中，特異度為91.8％；190例涂陰肺結(jié)核中，陽(yáng)性率為75.8％。曾誼等［9］用T-SPOT檢測(cè)菌陽(yáng)肺結(jié)核組陽(yáng)性率為89.1％，特異度為95.0％。趙靜等［10］對(duì)83例肺結(jié)核患者進(jìn)行T-SPOT檢測(cè)，陽(yáng)性率為83.1％，其中菌陽(yáng)肺結(jié)核43例，陽(yáng)性率為93.0％，菌陰肺結(jié)核40例，陽(yáng)性率為72.5％，健康對(duì)照50例，特異度為94.0％，同時(shí)證實(shí)T-SPOT檢測(cè)結(jié)核性胸膜炎和結(jié)核性腦膜炎2種肺外結(jié)核中也有較高的實(shí)用價(jià)值，尤其是結(jié)核性胸膜炎。項(xiàng)杰等［11］在40例結(jié)核病患者中進(jìn)行T-SPOT檢測(cè)陽(yáng)性率80.0％，在60例非結(jié)核呼吸道患者和健康對(duì)照組中檢測(cè)其特異性為98.3％。但也有國(guó)外報(bào)道［12］在經(jīng)痰培養(yǎng)或肺組織活檢確診的結(jié)核病患者中，T-SPOT的靈敏度為92％，但特異度僅為47％。

總體來講，基于細(xì)胞免疫為主的γ干擾素釋放試驗(yàn)作為臨床輔助診斷手段，雖然樣本來源不同，樣本量大小不同，不同的實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)的靈敏度和特異度均有所不同，但相對(duì)于涂片和培養(yǎng)等方法而言，大大提高了檢測(cè)的靈敏度，不失為一種有效的臨床檢測(cè)輔助手段。但I(xiàn)GRAs檢測(cè)的結(jié)果也會(huì)受多種因素的影響，如年齡、營(yíng)養(yǎng)不良、癌癥化療和結(jié)核-艾滋病共感染等。最主要的是，其使用費(fèi)用較高，限制了其在我國(guó)臨床的使用，且其實(shí)驗(yàn)周期超過24h，實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)繁瑣，也不適合口岸快速通關(guān)和臨床檢測(cè)。

2.2 T細(xì)胞亞群的測(cè)定（determination of T cell subgroup，OKT）：OKT方法有流式細(xì)胞儀法和抗堿性磷酸酶法。據(jù)農(nóng)初師［13］報(bào)道，肺結(jié)核病患者外周血中的CD3、CD4T細(xì)胞亞群數(shù)量下降，尤其是CD4顯著下降，但是CD8增加，CD4/CD8比值下降。由于T細(xì)胞亞群測(cè)定非特異性，在結(jié)核病的診斷上作用不太大，目前國(guó)內(nèi)也只用于動(dòng)態(tài)觀察結(jié)核患者的治療效果和患者預(yù)后。

3 基于體液免疫為主的試驗(yàn)

用于體液檢測(cè)的免疫方法主要是斑點(diǎn)免疫金滲透技術(shù)（膠體金法）、ELISA技術(shù)、免疫印跡法和基因芯片技術(shù)。不論采取哪種方法，其原理都是患者體內(nèi)特異性抗體與試劑盒所包被的抗原能夠特異性結(jié)合，而后通過一定的顯色方法獲得檢測(cè)結(jié)果。其檢測(cè)的靈敏度和特異度主要取決于各種方法所包被的結(jié)核特異性抗原的種類。

目前結(jié)核分枝桿菌是引起結(jié)核病的致病菌，其全基因組序列分析已于1998年完成其基因組編碼了大約1 000種蛋白，但大多數(shù)的蛋白功能卻不明確。

3.1 以細(xì)胞壁抗原為主的檢測(cè)方法

3.1.1 脂阿拉伯甘露聚糖抗原（lipoarabinomannan，LAM）：LAM抗原是分枝桿菌菌壁表面抗原。其核心骨架為甘露聚糖，側(cè)鏈為甘露糖、阿拉伯糖單位，分子以磷脂酰肌醇錨定在胞質(zhì)膜上，是糖基磷酸肌醇糖脂家族中的一員。至少有2類LAM，即araLAM和manLAM，分別來自于結(jié)核分枝桿菌H37Ra株和H37Rv Erdman株。LAM具有高免疫原性，能誘發(fā)速發(fā)皮膚反應(yīng)、血清學(xué)反應(yīng)、被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)，但不能誘發(fā)遲發(fā)皮膚反應(yīng)。

目前檢測(cè)市場(chǎng)上有很多檢測(cè)試劑盒是以LAM作為包被抗原或與38KD和16KD聯(lián)合作為包被抗原的檢測(cè)產(chǎn)品。國(guó)內(nèi)使用較多的包括上海奧普生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的TB-DOT診斷試劑。TB-DOT采用斑點(diǎn)免疫膠體金滲透技術(shù)，將結(jié)核分枝桿菌特異性抗原分離純化，點(diǎn)樣并固化在硝酸纖維素膜上，膜上包裹的LAM抗原捕獲人血清樣品中結(jié)核分支桿菌抗體，被捕獲的結(jié)核IgG抗體可用葡萄球菌A蛋白（SPA）膠體金綴合物標(biāo)記呈色（SPA能與IgG特異性結(jié)合）形成紅色斑點(diǎn)，根據(jù)是否出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)即可判斷陰、陽(yáng)結(jié)果，從而判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌抗體。李光明等［14］對(duì)50例單純性結(jié)核性胸膜炎和62例肺結(jié)核并胸膜炎患者進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)單純性結(jié)核性胸膜炎血清陽(yáng)性率為76.0％，檢測(cè)胸腔積液的陽(yáng)性率為96.0％。檢測(cè)肺結(jié)核并胸膜炎血清陽(yáng)性率為83.9％，檢測(cè)胸腔積液的陽(yáng)性率為87.1％。周衛(wèi)敏等［5］對(duì)431例肺結(jié)核患者進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為65.43％，其中菌陽(yáng)肺結(jié)核185例，陽(yáng)性率為69.19，％菌陰肺結(jié)核246例，陽(yáng)性率為62.60％。趙靜等［10］對(duì)83例肺結(jié)核患者進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為75.9％，其中菌陽(yáng)肺結(jié)核43例，陽(yáng)性率為79.1％，菌陰肺結(jié)核40例，陽(yáng)性率為72.5％，健康對(duì)照50例，特異度為70％。陽(yáng)幼榮等［15］對(duì)113例確診結(jié)核患者（69例肺結(jié)核、肺外結(jié)核44例）檢測(cè)，陽(yáng)性率為80.53％，非結(jié)核疾病組53例的陽(yáng)性率為30.19％，健康組50例特異度為90％。

相對(duì)于其他抗原而言，LAM抗原的特異性相對(duì)較差，這主要是因?yàn)橛脕頇z測(cè)患者LAM抗體的LAM抗原多是直接從結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物中純化而得的，由于LAM非還原端帽化結(jié)構(gòu)的存在，而這一結(jié)構(gòu)也存在于分枝桿菌的阿拉伯半乳聚糖中，這可能導(dǎo)致環(huán)境中的非致病分枝桿菌感染人體產(chǎn)生的抗體由這部分抗原表位激發(fā)進(jìn)而構(gòu)成抗體診斷出現(xiàn)假陽(yáng)性的重要來源。

3.1.2 結(jié)核菌糖類脂抗原（tuberculous glycolipid，TBGL）：TBGL抗原是分枝桿菌胞壁上的糖脂類物質(zhì)，具有菌屬特異性，是從H37Rv菌株分離純化而成。Maekura等［16］用在結(jié)核分枝桿菌H37Rv純化的海藻糖-6，6-二霉菌酸酯（索狀因子）作為抗原來診斷抗結(jié)核分枝桿菌免疫球蛋白，結(jié)果顯示糖脂類是血清學(xué)診斷中有效的抗原。隨后，Maekura等［16］在TDM中混入更多的親水性糖脂，構(gòu)建了一種新的結(jié)核糖脂類抗原，并利用這種抗原成功建立了一個(gè)高靈敏度的結(jié)核血清學(xué)試劑盒，并由日本協(xié)和醫(yī)藥株式會(huì)社生產(chǎn)為成品ELISA試劑盒。通過ELISA方法檢測(cè)，血清TBGL抗體對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核患者的靈敏感度為80％，肺外結(jié)核則為83.3％，特異度為96.6％［15］。

3.1.3 基因工程表達(dá)純化的結(jié)核分枝桿菌特異度蛋白（tuberculosis-specific antigen，TB-SA）：加拿大多倫多大學(xué)劉軍教授在研究中發(fā)現(xiàn)了一種結(jié)核分枝桿菌特異性較高的結(jié)核分枝桿菌特異度蛋白（tuberculosis-specific antigen，TB-SA），成都永安制藥有限公司利用該抗原研制的ELISA檢測(cè)試劑盒通過了國(guó)家藥監(jiān)局的批準(zhǔn)。李光明等［14］利用該試劑檢測(cè)單純性結(jié)核性胸膜炎血清陽(yáng)性率為72.0％，檢測(cè)胸腔積液的陽(yáng)性率為90.0％。檢測(cè)肺結(jié)核并胸膜炎血清陽(yáng)性率為80.6％，檢測(cè)胸腔積液的陽(yáng)性率為83.9％。魯啟超等［17］將該試劑用于成人結(jié)核病的診斷中，測(cè)得靈敏度為71.9％，特異度為91.9％。周衛(wèi)敏等［5］對(duì)431例肺結(jié)核患者進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為87.24％，其中菌陽(yáng)肺結(jié)核185例，陽(yáng)性率為89.19％，菌陰肺結(jié)核246例，陽(yáng)性率為85.77％. 3.2 以肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A（pulmonary surfactant associated protein A，SP-A）為主的檢測(cè)方法：肺結(jié)核主要通過飛沫傳播，肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白是飛沫的主要組成成分。而肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白主要分布于支氣管表面和肺泡氣液界面上，其中含量最多的是SP-A。它是一種親水性蛋白，在肺泡上皮細(xì)胞合成與分泌，在肺的先天性免疫應(yīng)答中有重要作用，同時(shí)可增加及減少炎性介質(zhì)的釋放。表面活性蛋白僅占表面活性物質(zhì)組成的10％，擔(dān)負(fù)著宿主呼吸系統(tǒng)防御功能，其中SP-A占總量的50％左右，SP-A在結(jié)核桿菌素質(zhì)免疫調(diào)節(jié)中扮演重要角色，通過正調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞甘露糖受體SP-A可提高人類巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)核分枝桿菌的能力。但該指標(biāo)在結(jié)核病的診斷上存在一定缺陷，抗結(jié)核治療對(duì)SP-A的影響較大，且其他疾病可能會(huì)導(dǎo)致該指標(biāo)存在假陽(yáng)性和假陰性的情況。SP-A在人類不同疾病中表達(dá)的水平是不一致的，如在艾滋病、矽肺、肺泡蛋白沉積癥的肺泡灌洗液中SP-A水平是升高的，而在細(xì)菌性肺炎、肺纖維化和囊性肺纖維化中表達(dá)是降低的。由于肺結(jié)核患者肺內(nèi)受累情況不同，結(jié)核菌感染的肺段與非受累的肺段SP-A的表達(dá)不同，不排除由于痰液稀釋可能導(dǎo)致測(cè)定痰液中SP-A低表達(dá)的可能性。Gold等［18］研究，在局麻下進(jìn)行纖維支氣管鏡檢查獲取肺泡灌洗液，同時(shí)抗結(jié)核治療1周及1個(gè)月后復(fù)查肺泡灌洗液，肺泡灌洗液樣本來源于通過X線確診的病變肺段及沒有病變受累的肺段，結(jié)果顯示肺結(jié)核病變受累肺段的肺泡灌洗液中SP-A的水平是降低的，抗結(jié)核治療后相應(yīng)肺段的SP-A水平升高，而未受累肺結(jié)核的肺段的SP-A水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。遲晶宇等［19］研究表明血清SP-A可作為反映肺泡毛細(xì)血管膜屏障功能損傷早期而敏感的外周血標(biāo)志物，檢測(cè)其水平有助于肺結(jié)核的診斷。

3.3 以多種抗原的混合為基礎(chǔ)的檢測(cè)：除以上抗原外，人們還發(fā)現(xiàn)了大量分泌蛋白，如Ag85復(fù)合物、38KDa蛋白、A60抗原、16KDa蛋白、14KDa抗原、31KDa抗原、MTB81（88kDa抗原）和BCG缺失抗原，如MPT64、ESAT-6、CFP-10、MTB48、KatG抗原、U1蛋白等。利用多種抗原的組合來提高結(jié)核病檢測(cè)的靈敏度，并提出了結(jié)核感染的“條形碼”理論，即在結(jié)核病特定的階段表現(xiàn)為特定抗原的存在或缺失。這一理論揭示了現(xiàn)有的結(jié)核免疫學(xué)診斷發(fā)展過程的一個(gè)缺陷，即用單一抗原來標(biāo)記結(jié)核病的特定的階段。上海榮盛生物科技有限公司利用致病性結(jié)核分枝桿菌3種（38KD、ESAT-6和CFP10）和4種（MPT64 Mtb68 Mtb6.8和Mtb16.3）特異抗原優(yōu)勢(shì)肽段制作的ELISA試劑盒，用以捕獲人血清或血漿中可能存在的結(jié)核抗體。王瑛等［20］實(shí)驗(yàn)證實(shí)其靈敏度70.4％（254/361），其特異度84.9％（245/288）。痰涂片陽(yáng)性和培養(yǎng)陽(yáng)性患者組中，陽(yáng)性率分別為74.1％和81.8％，菌陰肺結(jié)核組陽(yáng)性率為70.4％，特異度為84.9％。

蛋白芯片技術(shù)的應(yīng)用為多抗原的使用提供了一個(gè)新的平臺(tái)。它利用微陣列技術(shù)將純化的結(jié)核菌抗原固相于同一膜片上，使抗原抗體反應(yīng)在固相膜上快速進(jìn)行，再以免疫金作為標(biāo)記物在膜上顯色，然后通過加入芯片識(shí)別系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析。夏季等［21］利用該技術(shù)同時(shí)檢測(cè)LAM、38KD、16KD、CFP10、ESAT-6抗體，130例臨床標(biāo)本顯示，以任一抗體檢測(cè)陽(yáng)性診斷為結(jié)核病陽(yáng)性，則診斷結(jié)核病的靈敏度為92.0％，特異度為77.5％，正確率為83.1％。但該方法尚沒有通過認(rèn)可。

在芯片的結(jié)果判斷上，2項(xiàng)抗體檢測(cè)陽(yáng)性作為結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)的診斷試驗(yàn)確診患有結(jié)核病的價(jià)值較高，而以1項(xiàng)抗體陽(yáng)性作為診斷標(biāo)準(zhǔn)的診斷試驗(yàn)否定患有結(jié)核病的價(jià)值較高。

雖然生物芯片技術(shù)可以對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，但是其對(duì)設(shè)備以及操作技術(shù)的要求較高，限制了其在結(jié)核普查和流行病學(xué)中的應(yīng)用，然而在耐藥菌種檢測(cè)中具有極大的優(yōu)勢(shì)［22］。

4 免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)核病的影響因素分析

免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)核的方法因其經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)備受檢驗(yàn)檢疫等部門的關(guān)注。但在使用該方法的過程中，還應(yīng)關(guān)注造成其假陽(yáng)性和假陰性的原因，以便綜合評(píng)判，作出準(zhǔn)確的結(jié)論。影響其檢測(cè)結(jié)果的主要因素包括以下幾點(diǎn)。

4.1 造成假陽(yáng)性結(jié)果的因素

4.1.1 我國(guó)感染現(xiàn)狀：我國(guó)屬于結(jié)核病感染高危險(xiǎn)國(guó)家，感染例數(shù)多，患病人數(shù)多，新發(fā)患者多，死亡病例多，農(nóng)村患者多，耐藥患者多。相對(duì)于低結(jié)核發(fā)病國(guó)家，很多人存在自然結(jié)核菌感染的情況，在體內(nèi)存在一定的低水平抗體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前現(xiàn)有的結(jié)核患者只占結(jié)核感染人群的10％左右。

4.1.2 鳥分枝桿菌復(fù)合體（mycobacteriumavium complex，MAC）的感染：用鳥分枝桿菌致敏素進(jìn)行皮膚遲發(fā)反應(yīng)進(jìn)行評(píng)估認(rèn)為，7％～12％的成年人已經(jīng)是MAC的亞臨床感染者。而用抗體檢測(cè)，所用的抗原很有可能與MAC的抗原有同源性，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng)。

4.2 造成假陰性結(jié)果的因素

4.2.1 免疫水平的影響：不同人群機(jī)體的免疫水平存在差異，患者處于臨床感染的初期，體內(nèi)抗體水平較低，未達(dá)到檢測(cè)的最低量，尚處于“窗口期”，易產(chǎn)生抗體陰性。Yoshinari等［23］等報(bào)道，感染結(jié)核后1～2個(gè)月才能檢測(cè)到IgG，而這與國(guó)內(nèi)報(bào)道的有一定的區(qū)別，但究竟“窗口期”是多長(zhǎng)時(shí)間，尚無定論。

4.2.2 重癥患者：一些重癥肺結(jié)核患者（如HIV等）雖然痰結(jié)核菌陽(yáng)性，但由于免疫功能相對(duì)較弱，或用藥后抑制了免疫功能，抗體檢測(cè)容易出現(xiàn)陰性，但經(jīng)過治療，全身情況好轉(zhuǎn)后，抗體可以陽(yáng)轉(zhuǎn)。

4.2.3 老年人：老年人機(jī)體功能退行性病變，免疫系統(tǒng)功能紊亂，細(xì)胞免疫下降，一旦感染結(jié)核分枝桿菌或陳舊病灶復(fù)發(fā)，往往病情重，進(jìn)展快，易出現(xiàn)干酪樣壞死性空洞或纖維厚壁空洞，甚至發(fā)展為難治性肺結(jié)核。而其免疫學(xué)反應(yīng)卻易出現(xiàn)假陰性反應(yīng)。

4.3 其他影響因素

4.3.1 不同地區(qū)人群對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響：人類白細(xì)胞抗原組成不同，不同人群對(duì)來源于East-6和CFP10的蛋白的多肽抗原的識(shí)別存在較大差異。

4.3.2 治療的階段性對(duì)檢測(cè)的影響：白廣紅等［24］研究證明結(jié)核病患者受16KD、38KD、LAM3種抗原刺激產(chǎn)生的3種特異性抗體與患者感染結(jié)核菌的嚴(yán)重程度有著較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)患者受到結(jié)核菌嚴(yán)重感染時(shí)，結(jié)核抗體水平會(huì)增高；當(dāng)結(jié)核患者受到治療時(shí)，結(jié)合抗體水平會(huì)下降。如抗酸染色陽(yáng)性的菌陽(yáng)患者，結(jié)核生物蛋白芯片檢測(cè)的陽(yáng)性率達(dá)86.4％（184/213），經(jīng)過治療的住院患者，結(jié)核生物蛋白芯片檢測(cè)的陽(yáng)性率為51.3％，抗體水平下降。

劉尚武等［25］報(bào)道，未治療的結(jié)核患者，EAST-6、LAM和38KDa高于對(duì)照組，治療后，EAST-6、Rv2626c降低，而38KDa、LAM水平增高。治療8個(gè)月后，相比發(fā)病較輕的患者，中等程度和嚴(yán)重程度的患者具有較高的ESAT-6、FdxA和38KDa。而陳舊性結(jié)核的患者抗TBGL抗體和抗LAM的陽(yáng)性水平明顯高于無陳舊性結(jié)核的患者。

4.3.3 肺結(jié)核的侵犯范圍和損傷程度：肺結(jié)核的范圍越廣泛，IgG抗體的水平越高（P＜0.01），纖維空洞性結(jié)核中IgG和IgA抗體的水平最高，空洞只與抗38+16KDaIgG抗體水平有關(guān)（P＜0.01），而干酪性肺結(jié)核中IgA抗體的水平最高。雙側(cè)損害的患者，8個(gè)月后，38KD、LAM高于單側(cè)的肺損害。這一發(fā)現(xiàn)一方面提示這些關(guān)聯(lián)抗原特異性地受到抗結(jié)核治療的影響，同時(shí)也提示部分血清學(xué)標(biāo)志可以用來預(yù)測(cè)治療后果。

4.3.4 糖尿病的影響：糖尿病先于結(jié)核病占70％～85％。一般認(rèn)為，糖尿病患者血糖過高，組織內(nèi)含糖量也高，有利于結(jié)核桿菌的生長(zhǎng)繁殖，并且，高血糖導(dǎo)致白細(xì)胞吞噬能力下降，機(jī)體殺菌能力降低，有利于結(jié)核桿菌的存活，而同時(shí)，活動(dòng)性結(jié)核病能促使糖代謝進(jìn)一步紊亂。糖尿病患者尤其是2型糖尿病患者血清ADA明顯升高。

4.3.5 年齡的影響：抗38KD［26］和LAM的IgG和IgM抗體水平與年齡之間的關(guān)系是獨(dú)立且相反的，在兒童期，抗體水平較低，在老齡期，抗體水平高。

4.3.6 檢測(cè)方法的影響：除抗原的選擇外，CUTOFF值的設(shè)定等也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。

4.3.7 結(jié)核菌L型的存在

綜上所述，隨著結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的進(jìn)一步純化，促進(jìn)了結(jié)核病免疫學(xué)診斷的發(fā)展。但是結(jié)核分枝桿菌的抗原多而復(fù)雜且分枝桿菌的體液免疫反應(yīng)與HLAⅡ類抗原的表型密切相關(guān)，眾多的結(jié)核分枝桿菌特異性抗原在結(jié)核診斷中如何應(yīng)用尚無定論；并且不同患者的免疫細(xì)胞識(shí)別細(xì)菌的抗原不同，其反應(yīng)性有所不同，單獨(dú)一種抗原不能被所有結(jié)核患者的免疫細(xì)胞所識(shí)別；再加上眾多因素導(dǎo)致了免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)假陽(yáng)性、假陰性的存在。因此，相關(guān)蛋白抗原的融合表達(dá)或幾種抗原的聯(lián)合應(yīng)用是今后結(jié)核診斷的發(fā)展方向。

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（本文編輯：劉斯靜）

R52

A

1007-3205（2013）11-1475-06

2012-11-20；

2013-03-27

史玲莉（1977-），女，河北保定人，河北省出入境檢驗(yàn)檢疫局保健中心主管技師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事衛(wèi)生檢疫研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.11.047