硬骨魚類Na/Pi-Ⅱ型轉(zhuǎn)運載體蛋白家族研究與應(yīng)用現(xiàn)狀

■徐中玉 范兆廷 陳偉興 田 壯 段可馨

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖系，黑龍江哈爾濱 150030)

近年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中磷的過量投入已經(jīng)對水體造成了一定程度的污染。近期研究表明，魚類能夠吸收和保留日糧中磷的40%，剩下的60%污染了環(huán)境[1]。在日本，水產(chǎn)行業(yè)每年大約要消耗50萬噸的飼料[2]，而這些僅占世界的1.7%[3]，一般飼料中的磷含量為15～20 g/kg，魚日糧磷需求依賴飼喂密度、魚類的養(yǎng)殖條件、魚體大小以及生命階段等[4]。由于以上諸多因素的影響，通過減少飼料中磷的添加量這種現(xiàn)狀雖然能夠得到改善，然而也可能導(dǎo)致了魚類的磷缺乏癥。為了避免上述情況發(fā)生，及早診斷出魚類磷缺乏癥對于避免長期磷缺乏癥很重要，故需要一個靈敏的診斷標(biāo)記，使得魚類缺乏磷的狀態(tài)在初期就可以被迅速而又準(zhǔn)確的得以檢測，進(jìn)而飼料中的磷含量能夠得到精準(zhǔn)的定位。早期，已有學(xué)者對斑馬魚做出研究，表明腸道中的無機(jī)磷轉(zhuǎn)運蛋白（Na/Pi）對早期的磷缺乏癥能做出快速反應(yīng)。近年來，對于其他魚類該轉(zhuǎn)運蛋白的研究也日趨完善起來。該蛋白的深入研究對于改善人工飼養(yǎng)條件下的水體環(huán)境和魚類飼料的利用效率有積極意義。

1 Na/Pi-Ⅱ型轉(zhuǎn)運載體蛋白家族

1.1 Na/Pi-Ⅱ型轉(zhuǎn)運載體蛋白家族的組成

Na/Pi-Ⅱ型轉(zhuǎn)運載體蛋白基因家族代表了一組異源基因，故其分類的標(biāo)準(zhǔn)依賴于結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化。在人類中，Na/Pi-Ⅱ型轉(zhuǎn)運載體蛋白基因家族有51個家族成員，推斷至少能編碼378個功能蛋白，并且已從哺乳動物中分離出了3種類型，分別編碼3種鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白，即Ⅰ型（Na/Pi-Ⅰ）、Ⅱ型（Na/Pi-Ⅱ）和Ⅲ型（Na/Pi-Ⅲ）。

1.2 Na/Pi-Ⅱ型轉(zhuǎn)運載體蛋白

1.2.1 Na/Pi-Ⅱ型轉(zhuǎn)運載體蛋白的組成

Na/Pi-Ⅱ型轉(zhuǎn)運載體蛋白包括腎臟甲狀旁腺素敏感型鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白Ⅱa型和小腸頂端膜鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白Ⅱb型以及Ⅱc型3種類型[5-6]。Na/Pi-Ⅱa型和Na/Pi-Ⅱc型主要存在于腎臟中，Na/Pi-Ⅱb型主要存在于小腸中[7]。Na/Pi-Ⅱa與Na/Pi-Ⅱb在成骨細(xì)胞中表達(dá)，并以某種方式受無機(jī)磷調(diào)控，兩者具有明顯的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)相似性，但同功體Na/Pi-Ⅱa和Na/Pi-Ⅱb在3個親水區(qū)上表現(xiàn)出了明顯的差異性[8]，且Na/Pi-Ⅱb協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白的活性隨溶液的pH值增高而增高[9]。

1.2.2 Na/Pi-Ⅱ型轉(zhuǎn)運載體蛋白的調(diào)控機(jī)制

調(diào)控Na/Pi-Ⅱ型轉(zhuǎn)運載體蛋白對磷進(jìn)行轉(zhuǎn)運的因素有VD3[10]、低磷日糧[11]、鈣磷含量及鈣磷比[12]、腸道pH值[13]、鈉離子濃度[14]、胰島素和胰島素樣生長因子[15]、表皮生長因子（FGF）[16]、成纖維細(xì)胞生長因子23（FGF23）[17]、甲狀腺素[18]、降鈣素[19]和甲狀旁腺素[20]等。

VD3的調(diào)控機(jī)理分兩類觀點，即基因?qū)W說與非基因?qū)W說[10]。非基因?qū)W說認(rèn)為VD3可能是通過促進(jìn)小腸黏膜上皮細(xì)胞對磷進(jìn)行轉(zhuǎn)運從而提高吸收的效率，也可能是通過改變膜組成的變化、提高膜的流動性或者與其他因子(如FGF23)發(fā)生作用等來提高吸收的效率?；?qū)W說的觀點認(rèn)為，VD3可能調(diào)節(jié)了動物腸道內(nèi)Na/Pi與載體蛋白的結(jié)合位點數(shù)量。研究表明，VD受體缺陷型動物腸道Na/Pi mRNA的表達(dá)量受到影響，但mRNA轉(zhuǎn)錄水平無影響[21]。1，25（OH）2D-VDR（維生素受體）軸受損，則Na/Pi-Ⅱa表達(dá)量顯著降低，Na/Pi-Ⅱb表達(dá)量無差別[21]。

低磷日糧可以增加腸道刷狀緣膜頂端(BBMV)中Na/Pi-Ⅱb轉(zhuǎn)運載體蛋白數(shù)量，從而使Na/Pi轉(zhuǎn)運效率提高[11]，但Na/Pi-Ⅱb基因轉(zhuǎn)錄水平不隨日糧磷水平的變化而發(fā)生變化。鈣離子與磷酸根離子可形成不溶性的磷酸鹽，降低了磷酸鹽的溶解性，因而磷酸鹽中鈣含量升高則磷的相對生物學(xué)利用率降低。一般認(rèn)為，鈣磷比率高于2∶1，則磷在動物消化道中的吸收率降低。

不同種類動物消化道的pH值對腸道磷轉(zhuǎn)運速度的影響存在差別[13]。不同pH值通過改變鈉離子與磷轉(zhuǎn)運載體蛋白結(jié)合的親和力，從而影響刷狀緣細(xì)胞膜頂端對磷的吸收。動物小腸刷狀緣膜介質(zhì)中pH值一定時，提高Na+濃度可增加轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中轉(zhuǎn)運載體蛋白對磷的表觀親和力，加快Na+依賴型無機(jī)磷轉(zhuǎn)運速度，提高無機(jī)磷的轉(zhuǎn)運效率。胰島素樣生長因子-I是通過激活近端小管鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白來實現(xiàn)其功能的[15]。FGF參與Na/Pi轉(zhuǎn)運載體蛋白基因的轉(zhuǎn)錄過程，是通過調(diào)節(jié)Na/Pi-Ⅱa mRNA的表達(dá)量來抑制磷的重吸收[16]。這可能是因為FGF激活了蛋白激酶C（PKC）、蛋白激酶A（PKA）和有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑，負(fù)鼠細(xì)胞中FGF23含量的升高可導(dǎo)致Ⅱa型鈉磷轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)量增加。FGF23能導(dǎo)致血清磷含量減少，腎臟磷重吸收減少，腎臟中Na/Pi-Ⅱa和Na/Pi-Ⅱb mRNA的表達(dá)量降低[17]。

2 硬骨魚類Na/Pi轉(zhuǎn)運載體蛋白的研究與應(yīng)用

目前，硬骨魚類Na/Pi-Ⅱ型轉(zhuǎn)運載體蛋白基因家族已有50個基因被研究報道，推斷至少編碼338個功能蛋白[22]。

2.1 硬骨魚類Na/Pi轉(zhuǎn)運載體蛋白研究現(xiàn)狀

在高等脊椎動物中，通過多種異源表達(dá)系統(tǒng)對Na/Pi-Ⅱb蛋白的功能已進(jìn)行了評估。硬骨魚類中克隆的Na/Pi-Ⅱb蛋白的功能已被分析。斑馬魚中已發(fā)現(xiàn)的338個Na/Pi轉(zhuǎn)運載體蛋白中就有304個載體蛋白被研究，是魚類中的模式生物。其次是大西洋鮭有52個載體蛋白被研究、虹鱒有22個載體蛋白被研究、紅鰭東方鲀有16個載體蛋白被研究、暗紋東方鲀有11個載體蛋白被研究、日本鰻鱺有10個載體蛋白被研究。Na/Pi-Ⅱb基因序列僅有斑馬魚、虹鱒、鰈、鯉、鯊魚、鰩和棘魚被研究報道出來。到目前為止，已經(jīng)分離出了23種魚的小腸Na/Pi-Ⅱb基因序列。

2.2 硬骨魚類Na/Pi轉(zhuǎn)運載體蛋白的組織分布特點

哺乳動物中，通過抗體熒光染色技術(shù)發(fā)現(xiàn)Na/Pi-Ⅱb蛋白存在于腸道細(xì)胞的刷狀緣膜、肺泡頂端的細(xì)胞以及泌乳細(xì)胞的頂膜之中。在魚類中，Na/Pi-Ⅱb蛋白的作用部位存在個體差異性，如最新分離出來的觸須白魚和蒼白鰷魚的小腸Na/Pi載體蛋白基因與斑馬魚的小腸Na/Pi-Ⅱb1基因同源性高達(dá)83%，但與斑馬魚腎臟中的Na/Pi-Ⅱb2基因的同源性只有64%。相對來說，鯉、鯽、鮍、琵琶鯉和長吻似鮈小腸Na/Pi基因和斑馬魚腎臟中的Na/Pi-Ⅱb2基因同源性可高達(dá)85%，明顯高于小腸中的Na/Pi-Ⅱb1基因的同源性[23]。

研究表明，軟體動物的基因序列由于被不同結(jié)構(gòu)域隔開而無法與這些魚類進(jìn)行比較，因為這些魚類使用的PCR引物無法擴(kuò)增軟體動物的基因。盡管在多種條件下重復(fù)PCR實驗和組織重采樣，甲殼綱動物的Na/Pi基因仍然沒有被成功的分離出來。目前推測甲殼綱動物Na/Pi基因序列可能不同于脊椎動物和軟體動物。

2.3 硬骨魚類Na/Pi轉(zhuǎn)運載體蛋白的組織表達(dá)

哺乳動物Na/Pi-Ⅱb mRNA在小腸、肺、乳腺、睪丸和肝臟等許多組織中表達(dá)。存在于小腸和盲腸的Na/Pi mRNA對于初期磷的缺乏最為敏感。魚類中，Na/Pi基因的mRNA在組織中的分布同樣較為廣泛，在羅非魚中Na/Pi基因的mRNA存在于腸道、血液、脾臟和體表（魚鱗），且腸道中Na/Pi基因的mRNA含量在近端小腸較高，但是在遠(yuǎn)端腸較低甚至沒有。在鯽中，Na/Pi基因的mRNA存在的部位更為廣泛，包括腸道、脾臟和體表（魚鱗）、直腸、肝臟、腎臟、鰓、膘、心臟、脾臟和骨骼肌中，腸道中Na/Pi基因的mRNA含量的分布與羅非魚一致，近端小腸相對表達(dá)量大約70%左右，其含量已經(jīng)遠(yuǎn)高于性腺中。在鯽魚的血液中沒有Na/Pi mRNA，但羅非魚血液中存在Na/Pi mRNA，在鰓、腎臟和脾臟這些含有大量血細(xì)胞的組織中表達(dá)，所以，經(jīng)推測Na/Pi mRNA可能存在于魚類血液中，而不是這些組織中[24]。早期，通過Westernblotting技術(shù)已經(jīng)研究了虹鱒Na/Pi基因的組織分布[25]。近年來，運用RT-PCR技術(shù)對其組織分布情況進(jìn)行了再次檢測，證實了從腸道中分離出來的Na/Pi mRNA序列可以在多種組織中表達(dá)。

腸道中Na/Pi mRNA在魚的皮膚（鱗片）中表達(dá)，雖然與腸道表達(dá)水平相比表達(dá)量甚微，但從皮膚中提取的Na/Pi蛋白表明魚類可能通過體表吸收磷[24]。Na/Pi mRNA也在鰓中表達(dá)。這些研究結(jié)果都表明，魚類可能有過濾和消除溶解在水中的磷的能力。早期，Na/Pi協(xié)同轉(zhuǎn)運的相關(guān)蛋白存在于鰓中就有報道，但其是進(jìn)行磷的吸收還是排泄尚未確定。近年來還有研究報道，被檢測的斑馬魚組織中有大量砷酸鹽集聚的位置都有Na/Pi-Ⅱb1的表達(dá)[26]，特別是腸道、腎臟和眼睛這些組織，表明該蛋白是負(fù)責(zé)砷在體內(nèi)積累的運輸?shù)鞍住?/p>

2.4 硬骨魚類Na/Pi-Ⅱ型轉(zhuǎn)運載體蛋白三個亞型的研究現(xiàn)狀

目前的研究表明，斑馬魚、鳉、鱒魚和棘魚，有多條Na/Pi基因序列，在鯽魚腸道中只有一條Na/Pi基因序列被分離出來。在斑馬魚[27-28]上的研究表明，這些Na/Pi轉(zhuǎn)運蛋白亞型有多種不同的組織分布模式、不同的表達(dá)模式和不同的功能。此外，不同Na/Pi亞型可以以不同的方式對日糧磷含量的限制進(jìn)行調(diào)節(jié)。

在鮭魚，Na/Pi-Ⅱ型基因家族的三個亞型的組織分布模式都是相對獨立的。中腸Na/Pi亞型的相對表達(dá)量可達(dá)到100%，在幽門盲腸，末端小腸和直腸中相對表達(dá)量為中腸的13%～46%，在十二指腸的相對表達(dá)量為4.09%，僅次于幽門括約肌中。另外，在肝臟中也檢測出微量，其他的組織中未有檢出。幽門盲腸Na/Pi亞型在幽門盲腸中的相對表達(dá)量為100%，但是該亞型也在十二指腸和中腸中被檢測出。盲腸Na/Pi亞型基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在性腺中檢測出相對表達(dá)量為0.68%，肝臟中相對表達(dá)量為0.24%，但未在胃腸道的其他區(qū)域和其他組織中檢出。腎臟Na/Pi亞型基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物只特異性的存在于腎臟，在其他組織中未被檢測出。

在虹鱒的血液中沒有檢測到Na/Pi-Ⅱ型蛋白家族的三個亞型。羅非魚的血液中Na/Pi蛋白的作用有待研究。在斑馬魚中，Na/Pi轉(zhuǎn)運載體蛋白有兩個亞型在腸道上皮細(xì)胞中表達(dá)，分別為有不同功能屬性的Na/Pi-Ⅱb1(腸道亞型)和Na/Pi-Ⅱb2（腎臟亞型）。同時，研究Na/Pi基因的組織分布對于除腸道等組織以外的，如鰓和血液等可能對日糧磷限制最為敏感的組織有重要意義。

目前軟體動物只有兩條Na/Pi轉(zhuǎn)運蛋白基因相關(guān)序列（EST）被研究。盡管進(jìn)行了多次重復(fù)實驗，甲殼動物Na/Pi轉(zhuǎn)運蛋白基因序列的分離提取仍然不成功，表明甲殼動物的Na/Pi轉(zhuǎn)運蛋白基因序列可能與其他物種不同。但有幾種甲殼動物是重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，所以在這一領(lǐng)域有研究價值。

2.5 日糧磷水平對硬骨魚類Na/Pi轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)量的影響

在虹鱒中Na/Pi-I（腸道亞型）和Na/Pi-PC（幽門盲腸亞型）蛋白的組織分布是唯一的，表達(dá)量都受到日糧磷水平限制的影響。但是相比較而言，腸道亞型的表達(dá)量更依賴于日糧磷水平[29]。

早期對虹鱒一系列的研究表明，長期限制日糧磷增加腸道Na/Pi mRNA的表達(dá)[25，28，30-31]，但限制日糧磷對其他魚類Na/Pi mRNA表達(dá)的影響研究很少。近年來，對羅非魚的研究表明，日糧磷的限制（低磷飼養(yǎng)）并未增加腸道Na/Pi mRNA的表達(dá)量，骨磷的含量在低磷飼養(yǎng)和高磷飼養(yǎng)的情況下沒有明顯區(qū)別，低磷組的魚并非磷缺乏癥，因此，低磷組和高磷組Na/Pi mRNA的表達(dá)水平正常。羅非魚在飼喂低磷日糧條件下沒有出現(xiàn)磷缺乏癥，其機(jī)理尚不清楚。并且由于羅非魚是浮游生物攝食者，故其不僅攝食測試的日糧也攝食水域中的有機(jī)質(zhì)和微生物，其同樣可以提供一些磷來滿足攝食需求，并且魚類可能有能力通過鰓或者體表或鱗片吸收水體中的磷。

在鯽中，短期低磷飼養(yǎng)而不是長期低磷飼養(yǎng)的魚Na/Pi mRNA的表達(dá)量增加。低磷組魚骨磷含量明顯低于高磷組魚，表明低磷組魚磷缺乏。因此，短期低磷飼養(yǎng)條件下Na/Pi表達(dá)量的增加是合理的。但長期低磷飼養(yǎng)組并沒有明顯變化，仍需進(jìn)一步研究。

3 小結(jié)

在哺乳動物中，Na/Pi轉(zhuǎn)運蛋白基因家族編碼的三種鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白的研究已經(jīng)有較大的突破，尤其是Na/Pi-Ⅱ型家族的Na/Pi-Ⅱb蛋白的在動物營養(yǎng)中的研究與應(yīng)用取得了較好的結(jié)果。而在硬骨魚類中只有斑馬魚，虹鱒、鰈、鯉、鯊、鰩、棘魚和羅非魚等23種魚類的鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白的基因得以分離，在鯽的腸道中只有一條Na/Pi基因序列被分離出來，其他魚類，包括斑馬魚、鳉、鱒魚和棘魚，有多條Na/Pi基因序列被分離。斑馬魚[27-28]的研究表明，Na/Pi-Ⅱ型家族的三個亞型有多種不同的組織分布模式、不同的表達(dá)模式和不同的功能。此外，不同亞型可以以不同的方式對日糧磷含量的限制進(jìn)行調(diào)節(jié)。對于攝食浮游生物的魚類，如羅非魚，不僅攝食日糧也攝食水域中的有機(jī)質(zhì)和微生物（同樣可以提供一些磷來滿足攝食需求），故研究Na/Pi基因的組織分布對于那些對日糧磷限制最敏感組織，如鰓和血液很重要。短期低磷飼養(yǎng)條件下Na/Pi表達(dá)量的上調(diào)是合理的。但在長期低磷飼養(yǎng)組沒有明顯變化，仍需進(jìn)一步研究。故在未來研究中，分離Na/Pi-Ⅱ型家族的3個亞型和分析日糧磷水平對其影響是研究的重點。