關(guān)于血凝抑制試驗(yàn)中存在的十種問題及解決方法

鄒新海 李全宏 王海濤 （江蘇省邳州市畜牧獸醫(yī)站 221300）

劉 娟 （江蘇省邳州市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所）

關(guān)于血凝抑制試驗(yàn)中存在的十種問題及解決方法

鄒新海 李全宏 王海濤 （江蘇省邳州市畜牧獸醫(yī)站 221300）

劉 娟 （江蘇省邳州市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所）

隨著人們對動(dòng)物源性食品質(zhì)量衛(wèi)生安全要求的日益提高和動(dòng)物防疫檢疫工作的需要，實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)成為基層動(dòng)物防疫檢疫機(jī)構(gòu)的必要技術(shù)手段。某些病毒(如新城疫、禽流感病毒等)具有凝集某種動(dòng)物紅細(xì)胞的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象可被特異性免疫血清所抑制，即為紅細(xì)胞的血凝抑制。在基層工作中，微量血凝抑制試驗(yàn) (HI)廣泛應(yīng)用于禽流感、新城疫、產(chǎn)蛋下降綜合征和傳染性支氣管炎等母源抗體的檢測、雛雞首免日齡的確定、疫苗免疫后免疫應(yīng)答的監(jiān)測、臨床雞病的鑒別診斷等。血凝抑制試驗(yàn)是一種簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確且常用的血清學(xué)診斷方法。但不規(guī)范的試驗(yàn)操作常常常由于某些因素的影響，使試驗(yàn)結(jié)果不精確，有時(shí)甚至無法判定結(jié)果。下面把本人在試驗(yàn)中遇到的問題及解決方法作一總結(jié)。

1 紅細(xì)胞采集方法不當(dāng)

由于不同個(gè)體雞只紅細(xì)胞對病毒的敏感性不同從而影響HI效價(jià)，所以一般需要采取3只以上公雞紅細(xì)胞混合一起用，最好用非免疫公雞，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)準(zhǔn)備3～4只無特定免疫公雞，采血時(shí)，先用無菌的方法將一定比例的抗凝劑抽到采血器中，再去采血(一般采用翅靜脈采血)，將采出的3～4份雞血混合、離心，制備1%雞紅細(xì)胞。避免先采血后加抗凝劑，加入時(shí)間、方法不當(dāng)易產(chǎn)生血凝塊，影響檢測結(jié)果。翅靜脈采雞血時(shí)，由于血管較細(xì)，進(jìn)針后抽取速度要緩慢，速度過快、過猛時(shí)，容易導(dǎo)致血液充盈度減小，流通不暢、不易抽取。采血前均先用酒精脫脂棉球消毒，，采血完畢后用脫脂棉按壓1min左右，至不出血為止，避免造成血腫。

2 稀釋液的pH值選用不當(dāng)

稀釋液的pH值對試驗(yàn)有影響，稀釋液的pH值在5.8以下，紅細(xì)胞易自凝；pH值7.8以上凝集的紅細(xì)胞洗脫加快。因此應(yīng)選用pH值為7.0～7.2的PBS液或滅菌生理鹽水。

3 1%雞紅細(xì)胞的配制不當(dāng)

一般配制應(yīng)加生理鹽水或PBS適量，目的是洗去血清及紅細(xì)胞，防止紅細(xì)胞溶血，離心的轉(zhuǎn)速為1000轉(zhuǎn)/min，時(shí)間為10min，洗滌次數(shù)3～5次，不應(yīng)少于3次。離心結(jié)束后用吸管將上清液移去，切勿倒出去。離心好的紅細(xì)胞用吸管小心吸取，不能反復(fù)吹吸，以免造成紅細(xì)胞組織破壞，所余的紅細(xì)胞用生理鹽水或PBS稀釋100倍，放置4℃?zhèn)溆谩?/p>

4 被檢血清的保存不當(dāng)

被檢血清腐敗變性嚴(yán)重影響免疫抗體檢測。因此，血樣采集后要及時(shí)分離血清，分離后及時(shí)測定或放置在4℃冰箱內(nèi)保存，要力求新鮮，如暫時(shí)不測定可冷凍保存，血清使用前要充分搖勻。

5 病毒懸液和紅細(xì)胞懸液在使用前沒有搖勻

病毒懸液和紅細(xì)胞懸液如沒有搖勻，加入時(shí)濃度高低不一，會(huì)造成人為誤差?？乖图t細(xì)胞使用前一定要振蕩搖勻，保證每一孔中加入的濃度準(zhǔn)確一致。

6 4血凝單位(HAU)抗原配制不準(zhǔn)確

4個(gè)HAU抗原要現(xiàn)用現(xiàn)配，混懸液要混勻，配好的抗原室溫下放置不得超過4個(gè)h，不可反復(fù)凍融。為防止4個(gè)HAU抗原配制不準(zhǔn)確.在作HI試驗(yàn)前必須做4IU抗原校正。在微量反應(yīng)板的1～4孔均加入0.025ml生理鹽水。取4IU病毒液0.025ml加入第1孔內(nèi)，混勻后吸取0.025ml加入第2孔，依次倍比稀釋至第4孔，從第4孔吸取0.025ml棄之。每孔均加入0.025ml1%雞紅細(xì)胞懸液，輕輕混勻，室溫(20～25℃)下靜置40min后觀察結(jié)果。若有2孔凝集，則視為抗原配制正確。若1孔凝集、2孔以后均沉淀，則抗原配制濃度偏低，若前3孔均凝集、第4孔沉淀，則抗原配制濃度偏高。否則，需重新測定抗原效價(jià)，重新配制4個(gè)HAU抗原，并作4IU抗原校正，直至結(jié)果準(zhǔn)確。

7 4IU抗原和1%紅細(xì)胞的配制和用量不當(dāng)

配制好的4IU抗原在2～8℃保存條件下，3d內(nèi)效價(jià)基本無變化，1%紅細(xì)胞在2～8℃保存條件下，3d內(nèi)不會(huì)發(fā)生溶血。超過3d，4IU抗原和1%紅細(xì)胞會(huì)因自身效價(jià)降低和溶血而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，每次實(shí)驗(yàn)前要根據(jù)待測樣品數(shù)量計(jì)算一下本次實(shí)驗(yàn)需要多少的4IU抗原和1%紅細(xì)胞，適當(dāng)配置，避免因多配而引起浪費(fèi)。加入4IU病毒時(shí)應(yīng)該從稀釋倍數(shù)高的孔向稀釋倍數(shù)低的孔依次加入(即從后向前加)，避免滴加過程中移液槍頭被污染。振蕩的時(shí)間不能過短，一般不少于1min。

8 溫度控制、讀數(shù)時(shí)間不當(dāng)

一般是由于環(huán)境溫度低，或反應(yīng)作用時(shí)間短，結(jié)果還沒有完全顯示。在環(huán)境溫度20～25℃，經(jīng)過20～30min即可讀出抗原效價(jià)和血清抗體滴度。當(dāng)溫度過低，如低于15℃時(shí)，出現(xiàn)結(jié)果就要慢，往往需要超過40min才能出現(xiàn)清晰的結(jié)果。需靜置一段時(shí)間后再讀數(shù)。此時(shí)，亦可用恒溫培養(yǎng)箱來或室內(nèi)控制溫度和時(shí)間以保證實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行。

9 最佳溫度及讀數(shù)時(shí)間

試驗(yàn)過程中的環(huán)境溫度超過30℃時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)的要快。往往在15min左右就可讀數(shù)。一旦時(shí)間過長，結(jié)果就會(huì)消失，使整板無凝集現(xiàn)象，給人一種誤以為效價(jià)為0，或抗體滴度為12log2。故要求試驗(yàn)環(huán)境溫度不得超過30℃，應(yīng)及時(shí)讀數(shù)，不應(yīng)長時(shí)間拖延讀數(shù)時(shí)間。

10 注意微量血凝板的清洗對試驗(yàn)結(jié)果的影響

目前，實(shí)驗(yàn)單位和基層多使用一次性96孔V型板，使用后不用清洗。若使用玻璃材料的96孔凝集板，在試驗(yàn)結(jié)束后要按程序清洗干凈：試驗(yàn)完畢即將凝集板應(yīng)及時(shí)置水龍頭下沖凈血球(壓力大的水龍頭最好)，用自來水反復(fù)沖洗，再用含洗滌劑的溫水溶液浸泡30min，并在洗滌劑溶液中以棉拭子刷洗凹孔及板面，不能用尖硬的器具清除沉淀在孔底的污垢，待反應(yīng)板干燥后，放到25%～3%濃度的鹽酸中浸泡24h以上，撈出用自來水沖洗多次，最后以蒸餾水或超純水沖洗2～3次，在37℃溫箱中烘干備用，將血凝板正對日光燈，孔底光潔透明無可見沉淀附著物為準(zhǔn)。

總之，在進(jìn)行微量血凝抑制試驗(yàn)中，操作程序一定要規(guī)范、細(xì)致耐心，綜合考慮各方面的因素，發(fā)現(xiàn)問題及時(shí)糾正處理，才會(huì)獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以正確評價(jià)疫苗免疫的效果及輔助診斷病毒性疾病。

S851.4

C

1007-1733(2013)03-0042-02

2013–01–14）

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