海洋貝類活性肽的研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景

王 晶，吳燕燕 ，楊賢慶

(1.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州510300;2.上海海洋大學食品學院，上海201306)

生物活性肽屬于小分子物質(zhì)，具有可以被腸道直接吸收的營養(yǎng)特性，其天然活性、安全性以及高效性一直備受關(guān)注。早在2000多年前，我國就有《歷代本草》記載了海洋貝類的藥用價值。貝類作為我國近海的主要養(yǎng)殖物種，其年產(chǎn)量占我國總養(yǎng)殖量的80%，是一個豐富的天然活性肽資源庫。與在市面上用于食品、藥品、化妝品以及飼料工業(yè)的合成添加劑相比，從貝類中制備的活性肽安全性和效用都很高，因此成為了當前國內(nèi)外的熱門研究課題。

1 貝類活性肽的制備

生物活性肽，是指對生物機體的生命活動有益或具有生理作用的肽類化合物，又稱功能肽。目前研究的海洋貝類活性肽主要有ACE抑制肽、抗菌肽、抗氧化肽、抗腫瘤肽和神經(jīng)肽等等，關(guān)于其制備和功能活性也有許多研究及應(yīng)用的報道。由于天然貝類活性肽的含量較低，難以實現(xiàn)大批量生產(chǎn)。所以后續(xù)發(fā)展了水解貝類蛋白來提取功能活性肽的方法，有酸水解、發(fā)酵法和酶水解。酸解制備會影響肽的氨基酸組成和二級結(jié)構(gòu)從而破壞其活性，且過程難以控制;發(fā)酵法多適用于植物來源的多肽制備，并需要配合活性多肽的化學合成和基因工程修飾等技術(shù);而酶法制備活性肽不但生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品安全性高，并且水解進程易于控制，是目前制備活性多肽的主要方法。目前國內(nèi)外對于貝類活性肽的酶解研究主要集中在扇貝、貽貝、牡蠣和文蛤等近海貝類中。對貝類酶解蛋白的加工報道也是隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展而逐漸增多，由單一的單酶解工藝上升為雙酶復合酶解和多酶分步定向酶解得變革，相應(yīng)的也從貝類蛋白中提取出了不同功能的活性肽液。吳燕燕等［1-3］對合浦珠母貝抗氧化肽的酶解制備、分離純化以及其抗氧化活性進行了系統(tǒng)研究，采用Sephadex G-25分子篩層析法分離得到相對分子量分別為1437.5、833.7、421.9、244.7、89.0、17.4u 六種活性組分，并驗證了其抗氧化能力，通過細胞溶血實驗、對保濕活性的研究和添加到化妝品中的抗氧化效果驗證了貝類抗氧化肽在化妝品領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。單一酶水解作用是有限的，有時需要兩種酶解復合酶解起到互補的作用切斷相對應(yīng)的特異性肽鍵，從而提高水解率。張澤等［4］使用單因素實驗設(shè)計正交優(yōu)化中性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶酶解長牡蠣，并實驗酶解產(chǎn)物的還原能力和DPPH自由基清除能力。林孌等［5］通過Q檢驗法研究了中性蛋白酶和胰蛋白酶的復合比例，再通過正交試驗確定以風味蛋白酶二段酶解的最佳工藝參數(shù)，從而實現(xiàn)文蛤肉復合酶分布酶解工藝。

2 貝類活性肽的分離純化

采用酶法水解蛋白質(zhì)，得到活性肽液。為了進一步制備高純度的目標活性肽，可以根據(jù)各自的特性選擇合理的分離純化方法，能使分子量大小達到1000u以下。

2.1 膜分離技術(shù)

膜分離技術(shù)是在壓力差和濃度差等推動下的透過性膜，以截留相對分子量為指標，借助于膜的孔徑大小來篩選肽分子，從而實現(xiàn)肽的分離和純化。膜分離根據(jù)截留的分子量大小可分為微濾(MF)、超濾(UF)、納濾(NF)和反滲透(RO)。張艷萍等［6］比較了不同截留分子量的超濾膜對紫貽貝酶解物分離所得產(chǎn)物的ACE抑制活性，最后確定了截留分子質(zhì)量為10ku的超濾膜能將紫貽貝酶解物的ACE抑制率提高到89.42%;黃海等［7］用多種酶對扇貝邊進行深度水解后，采用超濾技術(shù)除去未水解的蛋白質(zhì)、細菌和微細顆粒等成分，成功富集了氨基酸和小分子肽。

超濾技術(shù)的操作條件溫和，活性肽受到溫度和pH等因素的影響較小，且處理量大，能避免加入其它溶劑污染分離物。但是超濾膜容易發(fā)生不可逆的污堵問題，且不易清洗，需要依具體情況選擇反洗或化學清洗處理，長此以往還會造成膜斷絲和閥門的損壞。

2.2 色譜法

目前常用于貝類活性肽純化的方法包括凝膠過濾法(GFC)、離子交換層析法(IEC)、高效毛細管電泳法(HPCE)和反相高效液相色譜法(RP-HPLC)等色譜技術(shù)。其中凝膠過濾色譜具有實驗條件溫和以及填料可反復使用的特點，被廣泛用于分離純化水溶性大分子的物質(zhì)，現(xiàn)較多地聯(lián)合幾種色譜方法使用，取長補短達到更好的純化效果。楊永芳等［8］采用反相高效液相色譜驗證了對貽貝水解物進行超濾、DEAE-sepharose離子交換和Sephadex G-25凝膠層析得到的一個抗腫瘤活性肽段的氨基酸序列為Asp-Leu-Tyr;Jiapei Wang 等［9］用 Sephadex LH-20 凝膠過濾色譜分離純化得到一種ACE抑制肽，反相高效液相色譜法測定序列為Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，并利用小鼠體外實驗得出該肽的半抑制濃度為66μmol/L。

2.3 聯(lián)用技術(shù)

酶解制備的活性多肽并不完全是活性最強的活性肽段的溶液，各肽段間大多具有相似性，所以使用單一的分離純化方法的效果不夠理想。通常需要多種方法聯(lián)用，一般多用膜技術(shù)結(jié)合幾種色譜技術(shù)，隨著對活性肽的分離純化、作用機理以及生理效果研究不斷深入，對其純度和結(jié)構(gòu)研究的要求也相應(yīng)提高，應(yīng)要求近些年出現(xiàn)了色質(zhì)聯(lián)用，如HPLC串聯(lián)質(zhì)譜和電泳與質(zhì)譜聯(lián)用。趙聽友等［10］將凝膠色譜與高效液相色譜法結(jié)合從南海桶形芋螺的毒液中純化出一種新的毒素BtIIIB，聯(lián)合氨基酸組成分析、質(zhì)譜分析和 Edman降解測定 BtIIIB的氨基酸序列為:CCELPCHGCVPCCWP，并用還原法衍生裂解，在MALDI-TOF MS中確定了其二硫鍵的配對方。Pedro等［11］先用HPLC-MS分離分析多肽混合物，再利用CE技術(shù)做進一步的分離純化實現(xiàn)了多種肽段的分離。

3 貝類活性肽的構(gòu)效研究

活性肽蘊藏于貝肉蛋白鏈的功能區(qū)內(nèi)，在母體蛋白鏈中并不表現(xiàn)其活性，經(jīng)過水解后才能暴露相關(guān)的活性位點。目前對于活性肽的生物活性與其結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系還不夠明確，因此其相關(guān)性研究一直是國內(nèi)外關(guān)注的熱點。雖然此類的報道不多，但可發(fā)現(xiàn)某些肽的活性和結(jié)構(gòu)有一定的普遍性規(guī)律，其功能活性與氨基酸的種類及序列密切相關(guān)，現(xiàn)對于活性肽構(gòu)效研究多圍繞肽的一級結(jié)構(gòu)、氨基酸組成比例以及肽的構(gòu)象分析。

3.1 貝類活性肽的分子量與活性的關(guān)系

國內(nèi)外研究報道了一些來自貝類蛋白的功能活性肽的分子量，發(fā)現(xiàn)較強活性的功能肽集中在3000u以下。汪秋寬等［12］檢測中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解牡蠣的活性肽抗氧化性時，發(fā)現(xiàn)兩種酶分別作用得到的最強羥自由基清除力的抗氧化肽分子量為1074、735u 以及 1191 和 826u。閻欲曉等［13］利用正交試驗優(yōu)化了三種酶酶解文蛤蛋白的條件，并用Sephadex G-50凝膠柱純化了達最佳清除率的三種酶解物，結(jié)果證明水解液中的抗氧化肽分子量集中在1000u以下。

3.2 貝類活性肽的一級結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系

活性肽分子表現(xiàn)出各自較強的活性往往與其自身的氨基酸組成和排序相聯(lián)系，甚至可以認為一些氨基酸結(jié)構(gòu)的存在決定了肽的功能活性。Won等［14］發(fā)酵藍貝沙司，提取純化其中的抗氧化肽，檢測序列為 Phe-Gly-His-Pro-Lyr。Rajapakse 等［15-16］從烏賊中獲得了兩種富含Gly和Leu的抗氧化肽，且兩種疏水性氨基酸出現(xiàn)頻率也較高，進一步研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵貽貝沙司中抗氧化肽的活性還與序列中的酸性氨基酸側(cè)鏈羧基螯合金屬離子相關(guān)。王日昕等［17］分離純化厚殼貽貝血清抗菌肽，經(jīng)過高效液相和氣質(zhì)聯(lián)用分析抗菌肽的氨基酸序列結(jié)構(gòu)，證實得到的3種抗菌肽N末端與地中海貽貝和紫貽貝抗菌肽具有較高的相似性。

3.3 貝類活性肽的構(gòu)象與活性的關(guān)系

肽的構(gòu)象包括二級結(jié)構(gòu)、疏水性以及二硫鍵等對功能肽的活性存在直接的影響。楊林等［18］深入探討了兩種新型人工抗菌肽mytilin-derived-peptide-1(MDP-1)和mytilin-derived-peptide-2活性差異的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，研究結(jié)果表明MDP-1和MDP-2均采取了典型的β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中疏水氨基酸和堿性氨基酸面積差異是造成兩者活性不同的原因所在。劉娜等［19］對中國南海新型芋螺毒素的化學合成、活性測定及表達條件進行了初步探討，中間環(huán)節(jié)采用兩步氧化折疊及HPLC共洗脫證實所測定的α-芋螺多肽折疊主產(chǎn)物的二硫鍵連接方式為Cys 1-Cys3和Cys2-Cys4。也有學者人工合成貝類抗氧化肽氨基酸序列，通過插入或刪除其中的一些序列結(jié)構(gòu)實驗其活性的變化。

目前對活性肽的構(gòu)效關(guān)系研究還處于探索階段，前期研究出的一些活性肽的結(jié)構(gòu)模型仍無法清楚解釋活性肽的作用機理。就前期研究來看，對ACE抑制肽、抗氧化肽和抗菌肽的結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系研究較多。ACE抑制肽一般含有10個以下氨基酸殘基，肽鏈 C 端主要為 Tyr、Pro、Trp、Phe 和 Leu，N 端為 Arg、Tyr、Gly、Val、Ala、Ile 和 Leu，且 C 端結(jié)構(gòu)對肽的活性影響較N端強，該結(jié)果符合Cheung H S(C端含有芳香族氨基酸)和Cushman D W(N端含有疏水性氨基酸)等的觀點，還有學者發(fā)現(xiàn)肽鏈中催化部位Zn(Ⅱ)和肽鍵的羰基氧之間的距離也影響其抑制活性［20］。目前，國內(nèi)外對抗氧化機理較明確的肽是肌肽和谷胱甘肽，其余的抗氧化肽結(jié)構(gòu)還沒有確切的定論，總結(jié)前人的研究可知，抗氧化肽由二至十幾個氨基酸殘基組成，通過含有的酸性氨基酸或組氨酸的側(cè)鏈螯合金屬離子減緩氧化作用，或者因為疏水性氨基酸的組合結(jié)構(gòu)容易結(jié)合氧加之以有質(zhì)子供體提供氫原子阻止自由基鏈式反應(yīng)，如Tyr和Trp。另外，還會受到抗氧化氨基酸以及氨基酸間短程相互作用的空間構(gòu)象影響。對比以上兩者，對抗菌肽有進一步的二級結(jié)構(gòu)研究，其分子量也相對較大，抗菌肽C端多含有疏水性氨基酸如Ala、Leu或Trp，N端富含堿性氨基酸如Lys、Arg，從而形成兩親分子，N端的正電荷會和菌膜的負電荷結(jié)合，C端進入膜脂質(zhì)雙分子層。多數(shù)抗菌肽的第二位氨基酸殘基為色氨酸或中間富含脯氨酸也會直接影響其抗菌活性;目前發(fā)現(xiàn)的抗菌肽種類中二級結(jié)構(gòu)共有四種構(gòu)型，β折疊只是穩(wěn)定構(gòu)象，C端環(huán)狀結(jié)構(gòu)比片層結(jié)構(gòu)對活性的影響較大，而α螺旋對抗菌肽的活性起到至關(guān)重要的作用［21］。

4 貝類活性肽開發(fā)過程中存在的問題

較國外的研究狀況，國內(nèi)對于貝類活性肽的研究與開發(fā)還比較薄弱，雖然近年來對貝類多肽的提取方法和活性的研究也取得了一定的進展，但要更進一步解析其結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系以及實現(xiàn)高純度活性肽的生產(chǎn)，還存在以下問題有待解決。

4.1 分離純化技術(shù)限制

熱點研究的貝類活性肽分子主要集中在3000u以下，鑒于市場那對目的活性肽的純度和活性要求，現(xiàn)有的純化手段還無法實現(xiàn)單一活性肽的分離富集。另外，含有目的肽的酶解液中存在的鹽分，在一定程度上也會影響肽的活性測定。針對在1000u以下的目的肽段來說，脫鹽一直是一個棘手的問題，這也是目前大多數(shù)貝類活性肽的研究只能集中在500u以上肽段的原因［22］。

4.2 定向酶解不穩(wěn)定

根據(jù)現(xiàn)有的生物技術(shù)和生物工程條件還無法實現(xiàn)對目的活性肽分子的精確酶切;另一方面，得到的目的肽分子的活性容易受到外界條件的影響，保存還需要進一步磷酸化、酰化和糖基化來穩(wěn)定肽段。

4.3 產(chǎn)生苦味

天然活性多肽苦味的產(chǎn)生是由于酶解過程中產(chǎn)生了一些具有苦味的疏水性氨基酸或其衍生物。目前多采用化學修飾掩蓋苦味和使用端肽酶及吸附樹脂去苦味［23］，但仍無法完全解決苦味的問題。

5 貝類活性多肽的應(yīng)用前景

5.1 在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用

自古以來，醫(yī)書上就有記載貝類的特殊療效，所以開發(fā)貝類功能活性肽在醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用具有廣闊的前景。目前開發(fā)較成功的當屬牡蠣產(chǎn)品，如“東海三豪”、“牡蠣EXT全營養(yǎng)片”以及“海王金樽”，而其他貝類的藥用研究主要集中在文蛤多肽的抗癌和抗腫瘤活性方面，例如上海市第二人民醫(yī)院已對文蛤中的不同蛋白質(zhì)成分做了小鼠驗證試驗和臨床驗證，結(jié)果表明其提取物在幫助腫瘤患者延長存活時間方面起到一定的作用［24］。國內(nèi)成功投產(chǎn)的貝類肽藥物有以海洋貝類?；撬釣橹饕煞值牧Χ嗑汪~蛋白等。抗氧化肽和ACE抑制肽具有延緩衰老，防止血管疾病的效用，此類保健品包括具有免疫調(diào)節(jié)兼具輔助降血糖功能的“銀蜊膠囊”和具有抗氧化功能的“銀蜊蛋白酶解肽粉”。

5.2 在食品行業(yè)的應(yīng)用

貝類活性肽營養(yǎng)豐富，且可以改善腸道和調(diào)節(jié)機體生理活動，所以作為功能食品開發(fā)有很好的前景。目前酶解貝類蛋白獲得氨基酸種類齊全的功能活性短肽產(chǎn)品，在市面上常見的是扇貝裙邊制品:海之味扇貝裙邊食品、扇貝調(diào)味汁，貝類調(diào)味品。蔡冰娜等［25］用動物實驗證明了牡蠣肽腸內(nèi)營養(yǎng)制劑對腸道功能的修復作用，理論證明了它對臨床病人腸道障礙發(fā)揮緩解作用的可行性。在食品保鮮貯藏及加工方面另一具有應(yīng)用價值的是貝類抗菌肽產(chǎn)品，抗菌肽具有較好的廣譜抗菌性，可作為食品天然防腐保鮮劑。宋宏霞等［26］用貽貝粗抗菌肽對鱸魚進行保鮮研究，結(jié)果證明了貽貝粗抗菌肽的抗菌效果與山梨酸鉀以及殼聚糖相當，具有廣闊開發(fā)前景。

5.3 在化妝品行業(yè)的應(yīng)用

天然抗氧化肽也是化妝品行業(yè)之新寵，大部分海洋活性多肽可以作為細胞生長因子，影響多種類型細胞的生長，對美容護膚、整形外科、燒傷潰瘍以及各種皮膚病的傷口修復與愈合都有極其明顯的效果。孫恢禮等［27-28］人與保健品公司合作，研制了一種含有海洋貝類活性肽的化妝品并公布其制備方法，另外還申請了一項應(yīng)用海洋貝類活性肽和海洋膠原蛋白肽細致毛孔的化妝品專利。

海洋生物因其生存環(huán)境的特殊性，使得海洋蛋白質(zhì)與陸地生物蛋白存在很大的差異，酶解釋放的活性多肽具有一定的優(yōu)越性。我國海洋貝類資源豐富，若能加強對海洋酶類的制取研究，就能提高貝類蛋白的酶解率和活性功能肽的制備能力，并實現(xiàn)海洋貝類的高值化利用，從而擴大用于各個工業(yè)領(lǐng)域中，以增強我國貝類活性肽開發(fā)利用的國際競爭力。

［1］Wu Yanyan，Li Laihao，Duan Zhenhua，et al.Application of Response Surface Methodology to Optimise Preparation High Antioxidant Activity Product from Pinctada Fucata Muscle［J］.Advanced Materials Research，2012，396-398:1341-1348.

［2］吳燕燕，尚軍，李來好，等.合浦珠母貝肉短肽的分離及其抗氧化活性研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(7):123-126.

［3］吳燕燕，田倩，尚軍，等.合浦珠母貝抗氧化肽的性質(zhì)及應(yīng)用研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(11):123-126，130.

［4］張澤，趙前程，程繼龍，等.長牡蠣蛋白雙酶水解工藝及其產(chǎn)物的抗氧化活性［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學，2012，52(11):2315-2317.

［5］林孌，陳麗嬌.文蛤肉復合酶分步酶解工藝的研究［J］.食品科學，2009，30(9):158-162.

［6］張艷萍，戴志遠，張虹.紫貽貝酶解物中降血壓肽的超濾分離［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36(9):46-51.

［7］黃海，尹玲.利用貝類廢棄物制造水解動物蛋白［J］.日照職業(yè)技術(shù)學院學報，2006，1(3):19-21.

［8］楊永芳，閆海強，丁國芳，等.貽貝水解物抗腫瘤活性肽的分離純化［J］.中國藥科大學學報，2011，(3):272-275.

［9］Wang Jiapei，Hu Jianen，Cui Jinzhe，et al.Purification and Identification of a ACE Inhibitory Peptide from Oyster Proteins Hydrolysate and the Antihypertensive Effect of Hydrolysate in Spontaneously Hypertensive Rats［J］.Food Chemistry，2008，111(2):302-308.

［10］趙聽友，曹瑛，代先東，等.新型桶形芋螺毒素BtIIIB的分離純化、氨基酸序列測定及二硫鍵定位研究［J］.化學學報，2005，63(2):163-168.

［11］Pedro Lozano，Didier Combes，Joseluis Ibovra，et al.Food protein nutrient improvement by protease at reduced water activity［J］.Journal of Food Science，1994，54(4):876-880.

［12］汪秋寬，劉紅丹，徐堅，等.牡蠣酶解液的抗氧化活性［J］.中國水產(chǎn)科學，2007，14(2):296-301.

［13］閻欲曉，粟桂嬌，李小梅，等.文蛤蛋白抗氧化活性肽的研究［J］.食品工業(yè)科技，2007，28(12):121-123.

［14］Won K J，Niranjan R，Se K K.Antioxidative activity of a low molecular weight peptide derived from the sauce of fermented blue mussel，Mytilus edulis［J］.Eur Food Res Technol，2005，220:535-539.

［15］Rajapakse N，Mendis E，Byun H G，et al.Purification and in vitro antioxidative effects of giant squid muscle peptides on free radical mediated oxidative systems［J］.J Nutr Biochem，2005，(16):562-569.

［16］Rajapakse Niranjan，Mendis Eresha，Jung Won-Wyo，et al.Purification of a radical scavenging peptide from fermented mussel sauce and its antioxidant properties［J］.Food Res Earch International，2005，38(2):175-182.

［17］王日昕，劉梅，廖智，等.厚殼貽貝抗菌肽Mytilin的初步鑒定［J］.水產(chǎn)學報，2010，34(1):153-158.

［18］楊林，范美華，劉雪珠，等.兩種合成抗菌肽的結(jié)構(gòu)及抗菌作用機理［J］.生物工程學報，2011，27(11):1564-1573.

［19］劉娜.中國南海新型芋螺毒素的化學合成、活性測定及表達條件初探［D］.青島:山東科技大學，2011.

［20］鄭炯，鄧惠玲，林茂，等.ACE抑制肽的酶法制備及其構(gòu)效關(guān)系的研究進展［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(15):418-422，427.

［21］魏照征，田健，伍寧豐，等.抗菌肽構(gòu)效關(guān)系及其表達策略研究進展［J］.生物技術(shù)通報，2011(2):7-11.

［22］李影，巨芳，張艷華，等.生物活性多肽的分離純化及其發(fā)展趨勢［J］.江蘇調(diào)味副食品，2009，26(3):33-36.

［23］段濤，葉磊.降血壓肽的研究及應(yīng)用前景［J］.江蘇食品與發(fā)酵，2008(4):14-17.

［24］陳漢源，叢笑倩，張昂，等.文蛤抽提物的抗癌研究［J］.腫瘤防治研究，1980，11(4):3-7.

［25］蔡冰娜，吳園濤，孫恢禮.牡蠣肽腸內(nèi)營養(yǎng)制劑對小鼠腸道功能作用的研究［J］.中國食物與營養(yǎng)，2010，(5):64-67.

［26］宋宏霞，曾名勇.紫貽貝抗菌肽的研究［D］.青島:中國海洋大學，2007:57-70.

［27］孫恢禮，陳華，陳忻，等.一種含有海洋貝類活性肽的化妝品及其制備方法和應(yīng)用:中國，201110079404.0［P］.2011-09-21［2012-08-28］.http://www.aptchina.com/faming/6643790/download.html.

［28］孫恢禮，陳華，陳忻，等.一種用于細致毛孔的海洋生物功能化妝品:中國，201110106633.7［P］.2011-09-14［2012-08-28］.http://www.aptchina.com/faming/6534792/download.html.