骨組織工程支架材料應(yīng)用于大段骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

李東亞，鄭 欣，陳一心

由損傷、感染、骨腫瘤術(shù)后等原因造成的大段骨缺損，其臨床治療方法包括骨延長術(shù)［1］、帶血管蒂骨移植術(shù)［2］等，其中最佳治療方法是骨移植，但由于自體骨移植供骨量有限且存在取骨區(qū)感染風(fēng)險，而同種異體骨移植存在傳染疾病的可能［3］，使得骨移植的應(yīng)用受到限制。1995年 Crane等［4］提出骨組織工程概念，即應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)的手段，將種子細(xì)胞種植到天然或人工合成的支架材料、細(xì)胞外基質(zhì)上，然后將復(fù)合細(xì)胞的支架材料植入到骨缺損部位，在支架材料降解的同時，種子細(xì)胞增殖分化為成骨細(xì)胞，從而修復(fù)骨缺損。骨組織工程的3個關(guān)鍵要素是支架材料、種子細(xì)胞和生物活性因子。根據(jù)其來源的不同，骨組織工程支架材料主要分為人工合成無機(jī)材料、人工合成高分子材料和天然生物衍生材料3種。近年來骨組織工程支架材料的設(shè)計及制作技術(shù)發(fā)展迅速，本文就幾種典型的支架材料應(yīng)用于大段骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展作一綜述。

1 磷酸三鈣 (tricalcium phosphate，TCP)

TCP的化學(xué)式為 Ca3(PO4)2，按結(jié)構(gòu)分為高溫相(α-TCP)和低溫相(β-TCP)。β-TCP具有良好的生物相容性、骨引導(dǎo)作用和可降解性能，利于宿主的細(xì)胞和血管長入材料，在形成新骨的同時材料被逐步降解吸收，從而完成新骨的“爬行替代”過程，在大段骨缺損的修復(fù)中主要應(yīng)用β-TCP。由于其缺乏骨誘導(dǎo)性，多采用具有骨誘導(dǎo)性的自體骨髓［5］、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(recombinant human bone morphogenetic protein，rhBMP)［6］等與其復(fù)合使用。Erbe 等［5］認(rèn)為，由于自體骨移植時供血延遲可造成移植骨死亡，而β-TCP多孔生物陶瓷的多孔結(jié)構(gòu)更利于血管化和細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)，β-TCP/自體骨髓復(fù)合材料在促進(jìn)新生骨供血方面比自體松質(zhì)骨移植效果更好。Busuttil等［7］比較了 rhBMP-7/β-TCP復(fù)合材料和單獨(dú)應(yīng)用β-TCP材料修復(fù)兔顱骨骨缺損時的成骨能力。在材料置入骨缺損3個月后處死動物，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)rhBMP-7/β-TCP復(fù)合材料組再生骨量占總?cè)睋p骨量的平均百分比為(29.41±6.25)%，遠(yuǎn)高于單獨(dú)應(yīng)用β-TCP材料組;力學(xué)性能檢測發(fā)現(xiàn)，rhBMP-7/β-TCP復(fù)合材料組遠(yuǎn)較單獨(dú)應(yīng)用β-TCP材料組好，其中應(yīng)用復(fù)合材料的某些個體，其新生骨力學(xué)性能甚至與正常骨相當(dāng)，可見rhBMP-7/β-TCP復(fù)合材料組在修復(fù)骨缺損時更有優(yōu)勢。但亦有生長因子與β-TCP復(fù)合后，不能表現(xiàn)出良好的修復(fù)骨缺損能力，如轉(zhuǎn)化生長因子 β3(transforming growth factor-β3 ，TGF-β3)等［8］。

提高TCP的骨誘導(dǎo)性不僅可通過復(fù)合細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)，還可通過聯(lián)合應(yīng)用種子細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。E等［6］研究了復(fù)合鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞(rat-adipose-derived stromal cells，rASCs)和rhBMP-2的β-TCP復(fù)合材料在骨組織工程的應(yīng)用。他們評估復(fù)合材料修復(fù)骨缺損能力的指標(biāo)包括，細(xì)胞附著能力、堿性磷酸酶活性、骨鈣素含量、鈣磷含量、基因表達(dá)等。分組實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，β-TCP可促進(jìn)鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞表型分化，材料中復(fù)合的生物活性因子rhBMP-2能顯著增加培養(yǎng)在β-TCP上的rASCs中鈣磷含量，堿性磷酸酶活性，骨鈣素mRNA水平、I型膠原含量等，因此rASCs/rhBMP-2/β-TCP復(fù)合材料修復(fù)骨缺損時再生骨量最多，修復(fù)骨缺損具有更大的優(yōu)勢。

盡管目前修復(fù)骨缺損的動物實(shí)驗(yàn)中多應(yīng)用β-TCP，然而也有學(xué)者認(rèn)為［9］，在復(fù)合材料中α-TCP較β-TCP有更好的成骨能力。他們在比較 α-TCP、β-TCP、羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)等3種支架材料修復(fù) Wistar大鼠直徑5mm的顱骨骨缺損時，將3種材料復(fù)合辛伐他汀，辛伐他汀可以刺激rhBMP-2表達(dá)，micro-CT檢查結(jié)果表明3種支架材料復(fù)合辛伐他汀組均較不復(fù)合組有更好的成骨效果，而復(fù)合辛伐他汀同時也影響了α-TCP和β-TCP的降解，α-TCP較β-TCP具有更高的降解率而骨再生更多，復(fù)合辛伐他汀的α-TCP更加增強(qiáng)了這種優(yōu)勢。

2 羥基磷灰石 (hydroxyapatite，HA)

HA是最穩(wěn)定的磷酸鈣形式之一，其化學(xué)式為 Ca10(PO4)6(OH)2，是常見的生物活性材料。HA用于骨組織工程修復(fù)大段骨缺損的優(yōu)點(diǎn)是較好的生物相容性、骨傳導(dǎo)性、可降解性。有學(xué)者［10］在動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)HA修復(fù)骨缺損的效果與自體骨移植相當(dāng)，不過HA缺點(diǎn)是很脆，拉伸性很差。HA作為骨組織工程支架材料應(yīng)該具備合適的孔隙率以利于新的骨組織生成及機(jī)體微環(huán)境交換，具備適宜的表面以利于細(xì)胞附著、遷移、擴(kuò)散，因此多孔結(jié)構(gòu)的支架材料應(yīng)用較多。Heo等［11］應(yīng)用冷凍干燥技術(shù)，制作新型納米級(HA顆粒直徑20～90納米)和微米級(HA顆粒直徑20～80μm)的HA/聚己內(nèi)酯復(fù)合支架;盡管兩種材料均為高度多孔材料，具有相似的孔徑和孔隙率(72% ～73%)，然而其顆粒直徑的顯著不同造成顯著差異的機(jī)械性能。兩者彈性模量分別是(3.187±0.06)兆帕和(1.345±0.05)兆帕，前者的彈性模量明顯大于后者，表現(xiàn)出更好的機(jī)械性能。Heo等［12］進(jìn)一步應(yīng)用電子掃描顯微鏡、組織染色等比較上述納米級和微米級HA/聚己內(nèi)酯復(fù)合支架的成骨效果，發(fā)現(xiàn)前者較后者更易黏附和增殖間充質(zhì)干細(xì)胞，骨缺損處有更多的鈣和堿性磷酸酶，可見納米級較微米級HA支架修復(fù)骨缺損時更有優(yōu)勢。目前已有臨床應(yīng)用的報道證實(shí)，納米級HA/膠原復(fù)合材料應(yīng)用于臨床口腔科治療牙周骨缺損時較開放皮瓣清創(chuàng)術(shù)效果更好。

與其他生物材料不同，納米級HA復(fù)合金屬材料還具有較好的抗菌功能［13-14］。Sahithi等［14］通過掃描電鏡、紅外光譜和X射線衍射技術(shù)合成和表征納米級HA和納米級HA/Cu復(fù)合材料，并在兩種材料上接種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌，比較菌株數(shù)后發(fā)現(xiàn)納米級HA/Cu復(fù)合材料具有較好的抗菌能力，而且復(fù)合聚乙二醇400的納米級HA/Cu材料表現(xiàn)出對革蘭氏陽性菌更好的抗菌效果，該研究還證實(shí)了聚乙二醇400-納米級HA/Cu復(fù)合材料不具有細(xì)胞毒性。

3 聚己內(nèi)酯 (polycaprolactone，PCL)

聚己內(nèi)酯屬半結(jié)體聚酯，易溶于有機(jī)溶劑，具有良好的生物相容性，穩(wěn)定的物理和機(jī)械屬性［15］，是一種被廣泛關(guān)注的高分子合成材料。但是聚己內(nèi)酯在機(jī)械強(qiáng)度、生物活性及骨誘導(dǎo)能力方面仍有不足［16］，骨組織工程中亦多應(yīng)用其復(fù)合材料。Reichert等［17］比較了PCL-TCP和HA-SF(silk fibroin，SF)與自體骨髓移植治療羊脛骨大段骨缺損時的成骨效果;術(shù)后12周，X射線，扭轉(zhuǎn)測試和定量計算機(jī)斷層掃描分析表明，骨缺損在自體骨髓移植組完全橋接，在PCL-TCP組部分橋接，而HA-SF組僅有少量骨生成;生物力學(xué)測試顯示，PCL-TCP組和自體骨髓移植組的新生骨扭矩/剛度值之間無顯著差異;他們認(rèn)為結(jié)合成骨細(xì)胞或生長因子的PCLTCP材料將表現(xiàn)出更好的修復(fù)骨缺損能力。Cai等［18］將人類胚胎干細(xì)胞來源的間充質(zhì)干細(xì)胞種植在L-乳酸-聚己內(nèi)酯復(fù)合材料上，修復(fù)兔脛骨骨缺損，X線和組織學(xué)檢測證實(shí)了支架內(nèi)外有較多新骨生成。Laird等［19］研究了燒結(jié)牛松質(zhì)骨化學(xué)滲透PCL后的機(jī)械性能，機(jī)械壓縮試驗(yàn)表明燒結(jié)牛松質(zhì)骨化學(xué)滲透PCL后彈性模量增加，PCL可優(yōu)化燒結(jié)牛松質(zhì)骨在骨移植中的應(yīng)用。

4 殼聚糖 (chitosan，CTS)

殼聚糖屬于天然生物衍生物，化學(xué)名為(1，4)聚-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖，可通過化學(xué)法和酶解法獲得，是甲殼素脫乙酰基的產(chǎn)物，而甲殼素是甲殼類動物外骨骼的主要組成部分。因而殼聚糖除了具有較好的骨傳導(dǎo)性，還有良好的生物相容性，但是其機(jī)械強(qiáng)度較差［20］。由于碳納米管具有高楊氏模量、高抗拉強(qiáng)度和高斷裂伸長率［21］，人們研制出了碳納米管復(fù)合殼聚糖天然聚合物材料以增加機(jī)械強(qiáng)度［22］，當(dāng)0.8%的碳納米管均勻地分散在整個CTS矩陣時，復(fù)合材料較單純殼聚糖的拉伸模量和機(jī)械強(qiáng)度提高了約93%和99%。為進(jìn)一步提高殼聚糖的力學(xué)性能和生物相容性，Kavya等［20］將殼聚糖與硫酸軟骨素及納米級二氧化硅復(fù)合，復(fù)合支架材料表現(xiàn)出豐富的孔隙率、生物降解性、機(jī)械完整性、礦化和蛋白質(zhì)可吸附性;而且涂布纖維蛋白的該納米支架能更好地黏附細(xì)胞，這種新型復(fù)合材料支架較為適合應(yīng)用于骨組織工程。動物實(shí)驗(yàn)研究表明［18］，可注射性納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合支架修復(fù)大段骨缺損效果很好，他們在新西蘭大白兔左股骨髁處制作直徑6mm，長10mm的大段骨缺損，術(shù)后12周，應(yīng)用納米羥基磷灰石/殼聚糖組的骨缺損完全愈合，而單純應(yīng)用殼聚糖組的骨缺損愈合尚不完全。

為了從基因水平探討殼聚糖單體影響成骨的過程，Ganno等［23］利用低濃度殼聚糖單體培養(yǎng)成骨細(xì)胞。殼聚糖單體誘導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶及堿性磷酸酶基因等4個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)的增加。低濃度的殼聚糖單體直接影響成骨細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)mRNA水平，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的活性。鑒于生物活性因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等在成骨中具有重要作用，可將該類因子與殼聚糖聯(lián)合應(yīng)用，Si等［24］應(yīng)用基因工程技術(shù)，將轉(zhuǎn)染了VEGF的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞種植在納米級HA/羥甲基殼聚糖復(fù)合支架上，用于修復(fù)兔橈骨骨缺損;術(shù)后12周，復(fù)合材料組已經(jīng)有較多新骨生成;術(shù)后24周，新骨生成較12周時明顯增多，同時復(fù)合材料僅有較少的殘存，大部分已降解。雖然應(yīng)用基因工程，殼聚糖復(fù)合材料修復(fù)骨缺損效果較好，但尚未得到臨床應(yīng)用。

5 絲素蛋白(silk fibroin，SF) 絲素蛋白是一種可降解的生物大分子，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能可調(diào)，骨再生能力良好，可作為理想的骨組織工程支架材料［25］。絲素蛋白較高分子聚合材料的優(yōu)點(diǎn)包括:具有水溶性使得制作支架材料過程中可避免使用有毒的有機(jī)溶劑，同時具有可控的生物降解性有利于骨細(xì)胞順利長入支架材料［26］。但其機(jī)械性能不佳，常選用具備較高機(jī)械性能的材料與其復(fù)合應(yīng)用于骨組織工程。

鑒于生物活性玻璃具有較好的機(jī)械性能，Wu［27］等比較了多孔生物活性玻璃/絲素蛋白材料、普通生物活性玻璃/絲素蛋白材料與單純絲素蛋白修復(fù)骨缺損時的成骨能力，實(shí)驗(yàn)中骨缺損動物模型為免疫缺陷小鼠3mm直徑全層顱骨骨缺損。3種材料具有相似的孔隙率(約75%)，術(shù)后8周處死小鼠，缺損處行micro-CT掃描以及組織學(xué)分析，結(jié)果表明多孔生物活性玻璃/絲素蛋白材料的新生骨量較其他兩組多，他們認(rèn)為多孔生物活性玻璃/絲素蛋白材料非常適合做組織工程生物活性支架。該試驗(yàn)同時反映了單純使用絲素蛋白修復(fù)骨缺損的效果有限。但并不是所有的絲素蛋白復(fù)合材料的成骨能力都是良好的，Kweon等［28］在比較納米級HA復(fù)合絲素蛋白與單純納米級HA修復(fù)兔直徑8mm顱骨骨缺損的成骨能力，發(fā)現(xiàn)術(shù)后8周應(yīng)用組織計量學(xué)測得單純納米級羥基磷灰石的骨再生比率(40.16±8.27)%遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白對照組(25.66±10.98)%和復(fù)合材料組(16.62±3.05)%，這表明復(fù)合材料的應(yīng)用仍有很多需要改進(jìn)的地方，如復(fù)合材料的孔徑及孔隙率的控制等。

孔隙結(jié)構(gòu)的優(yōu)化可顯著改善絲素蛋白支架材料的成骨效果，Zhang等［29］應(yīng)用冷凍干燥技術(shù)，制作了4組孔徑在50～300μm之間的三維絲素蛋白支架，并將轉(zhuǎn)染BMP-7基因的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)在這4組支架，然后置入免疫抑制小鼠的骨缺損處，觀察其成骨反應(yīng)。他們應(yīng)用細(xì)胞活力比色法、堿性磷酸酶檢測和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)分析孔徑對細(xì)胞的生長和成骨細(xì)胞分化的影響。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染BMP7的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在孔徑為100～300μm的三維絲素蛋白支架上生長良好，有較多新生骨組織出現(xiàn)，可見優(yōu)化孔隙結(jié)構(gòu)的三維絲素蛋白支架可以調(diào)節(jié)BMP7轉(zhuǎn)染的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在骨形成過程中的生物活性。有報道指出［30］，堿性水解法獲得的微米級絲素纖維(10～600μm)，其抗壓強(qiáng)度可達(dá)13兆帕，而且這種方法獲得的絲素材料表面粗糙、多孔、高硬度，適合于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向骨樣組織分化及骨標(biāo)記基因表達(dá)，同時該材料在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出較低的免疫反應(yīng)。

雖然系統(tǒng)的骨組織工程學(xué)研究歷史不長，但骨組織工程支架材料的制備方法和制備技術(shù)都已有了長足進(jìn)步，如納米技術(shù)、基因工程等，多種新型復(fù)合骨組織工程支架材料在動物試驗(yàn)中修復(fù)大段骨缺損的效果得到肯定。但是目前對細(xì)胞與骨組織工程支架材料的相互作用研究還停留在細(xì)胞水平。隨著骨組織工程研究的不斷深入，相信骨組織工程支架材料能更加完善地結(jié)合種子細(xì)胞、生物活性因子以高效地修復(fù)大段骨缺損。在不久的將來，骨組織工程支架定會在大段骨缺損的臨床治療中發(fā)揮重要作用。

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