黏附因子CD44的活化狀態(tài)及其在腫瘤靶向治療中的研究進(jìn)展＊

侯利丹 綜述，高 鋒 審校

（上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 200233）

CD44（cluster of differentiation 44）指白細(xì)胞分化抗原簇第44號，是一類重要的黏附分子，廣泛分布于細(xì)胞表面，如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等［1］。不同細(xì)胞表面CD44與透明質(zhì)酸（HA）結(jié)合活性不同，活化狀態(tài)存在很大差異。許多正常細(xì)胞表面CD44處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，而許多腫瘤細(xì)胞表面CD44處于高度活化狀態(tài)，能與其主要配體HA結(jié)合，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等［2-6］。目前，有關(guān)CD44活化的調(diào)控機(jī)制仍未完全闡明，但隨著對CD44研究的不斷深入，其與腫瘤的關(guān)系越來越受關(guān)注，特別是以CD44為靶點(diǎn)進(jìn)行腫瘤靶向治療已經(jīng)成為腫瘤研究的焦點(diǎn)［7-9］。本文對CD44分子活化狀態(tài)及其在腫瘤靶向治療中的作用綜述如下。

1 CD44的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能

CD44基因由一組高度保守的外顯子組成，約有50～60 kb，位于人的第11號和小鼠的第2號染色體上［10］。根據(jù)其外顯子的表達(dá)方式不同可分為兩型：CD44標(biāo)準(zhǔn)型（CD44s）和CD44變異型（CD44v）。CD44蛋白結(jié)構(gòu)可分為3部分：N-端結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和C-端結(jié)構(gòu)域。N-端結(jié)構(gòu)域含有與HA結(jié)合的必須序列，是CD44發(fā)揮生物學(xué)功能的重要區(qū)域，C-端結(jié)構(gòu)域可作為蛋白激酶C的底物被磷酸化，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，并且通過錨蛋白與細(xì)胞骨架相連。CD44蛋白的主要功能可歸納為：（1）作為歸巢受體介導(dǎo)淋巴細(xì)胞與毛細(xì)血管后小靜脈中的高柱狀內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，促使淋巴細(xì)胞穿過血管壁回到淋巴組織；（2）參與淋巴細(xì)胞，尤其是T淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞等的激活，在激活過程中，CD44與其主要配體HA或相應(yīng)抗體結(jié)合，作為共刺激分子，能夠增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的功能；（3）參與細(xì)胞間的黏附，促進(jìn)成纖維細(xì)胞和淋巴細(xì)胞與HA、硫酸軟骨素及層粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合；（4）能與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞偽足形成，并與細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)有關(guān)［11-12］。

2 細(xì)胞表面CD44的活化狀態(tài)

CD44是HA在細(xì)胞表面最主要的受體。HA是一種由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸為結(jié)構(gòu)單元的高分子黏多糖，為細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分，能夠與腫瘤細(xì)胞表面CD44結(jié)合，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。但是CD44與HA的結(jié)合并不完全是自發(fā)的。CD44處于3種不同狀態(tài)：（1）靜止?fàn)顟B(tài)，不能與HA結(jié)合；（2）可誘導(dǎo)激活狀態(tài)，CD44需要在特異抗CD44單抗或者激活劑（如佛波酯）的誘導(dǎo)下，才能夠被激活，與HA結(jié)合；（3）組成性激活狀態(tài)，不需要任何激活劑，CD44即可以與HA結(jié)合［13］。CD44的活化狀態(tài)主要體現(xiàn)在與其主要配體HA的結(jié)合活性上，受到多種因素的影響。研究發(fā)現(xiàn)，大部分造血系統(tǒng)細(xì)胞表面CD44處于誘導(dǎo)激活狀態(tài)，不能自發(fā)結(jié)合HA［14］，如B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，經(jīng)佛波酯或CD44抗體刺激可使其表面CD44受體活化，與HA結(jié)合。Levesque等［4］觀察到新鮮分離的人外周血單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞均不能與HA結(jié)合，在體外培養(yǎng)8～16h后，部分單核細(xì)胞即可與HA結(jié)合，植物血凝素和抗體OKT3刺激可顯著提高單核細(xì)胞與HA結(jié)合活性，而大部分淋巴細(xì)胞仍不能與HA結(jié)合，提示外周血單核細(xì)胞表面CD44處于可誘導(dǎo)激活狀態(tài)，經(jīng)誘導(dǎo)可與HA結(jié)合，許多淋巴細(xì)胞表面CD44處于靜止?fàn)顟B(tài)，不能與HA結(jié)合。許多腫瘤細(xì)胞如乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞，其表面CD44能自發(fā)結(jié)合HA，處于組成性激活狀態(tài)［15-16］。

3 CD44不同活化狀態(tài)的調(diào)控機(jī)制

CD44的不同活化狀態(tài)究竟受何調(diào)控，目前仍未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)后多數(shù)單核細(xì)胞表達(dá)高相對分子質(zhì)量CD44v，具有活性，而大部分淋巴細(xì)胞不表達(dá)，處于靜止?fàn)顟B(tài)，僅少數(shù)表達(dá)CD44v6的淋巴細(xì)胞處于活化狀態(tài)［17］，表明CD44與HA的結(jié)合可能與CD44異構(gòu)體相關(guān)。Perschl等［18］發(fā)現(xiàn)CD44細(xì)胞質(zhì)段缺失可使T淋巴瘤細(xì)胞喪失與HA結(jié)合的活性，但是將細(xì)胞質(zhì)段缺失的CD44通過二硫鍵結(jié)合形成CD44二聚體后，CD44能夠與HA結(jié)合，表明CD44細(xì)胞質(zhì)段可能參與CD44在細(xì)胞膜上的分布，促使CD44在細(xì)胞膜上的聚集，誘導(dǎo)其與HA結(jié)合，該研究提示CD44在細(xì)胞表面的分布變化，可調(diào)節(jié)其與HA的結(jié)合。Katoh等［3］發(fā)現(xiàn)中國倉鼠卵巢細(xì)胞CD44糖基化缺失株可以結(jié)合HA。用糖基化抑制劑處理CD44失活的細(xì)胞株，可以使CD44相對分子質(zhì)量降低并促使其與HA結(jié)合，提示CD44過度糖基化可能占據(jù)其與HA的結(jié)合區(qū)域，導(dǎo)致CD44不能與HA結(jié)合。Peck等［19］將CD44陰性的人黑色素瘤細(xì)胞和鼠T淋巴瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染CD44，轉(zhuǎn)染可以引起其與HA結(jié)合。但是，Swiss小鼠胚細(xì)胞NIH3T3轉(zhuǎn)染CD44后，仍不能結(jié)合HA，提示CD44與HA結(jié)合同時(shí)也受細(xì)胞類型的影響［5］。HA與CD44的結(jié)合也受到HA狀態(tài)的影響，有學(xué)者認(rèn)為交聯(lián)狀態(tài)的HA可能提高HA與CD44的親和力［20］。綜上所述，CD44與 HA結(jié)合主要與 CD44構(gòu)型［21］、受體分布［18］、糖基化［3，22］等相關(guān)，同時(shí)也受細(xì)胞類型［5］、HA 自身存在狀態(tài)［20］等調(diào)控。

4 腫瘤細(xì)胞活化的CD44作為靶點(diǎn)在腫瘤靶向治療中的應(yīng)用

許多正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞均表達(dá)CD44，但其活化狀態(tài)不盡相同。Tzircotis等［5］檢測乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231、MDAMB-468及Swiss小鼠胚細(xì)胞NIH3T3表面CD44的表達(dá)水平和活性，發(fā)現(xiàn)上述細(xì)胞均高表達(dá)CD44，正常小鼠胚細(xì)胞NIH3T3與HA結(jié)合活性極低，乳腺腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-468與HA結(jié)合活性很高；Bachar等［23］也證實(shí)頭頸癌患者腫瘤細(xì)胞表面CD44能結(jié)合HA，瘤旁正常組織不能與HA結(jié)合；本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMCs、Swiss小鼠胚細(xì)胞NIH3T3、人皮膚原代細(xì)胞、小鼠肺成纖維細(xì)胞L929、小鼠成骨細(xì)胞MC 3T3-E1等正常細(xì)胞高表達(dá)CD44，但是CD44與HA結(jié)合活性極低，處于相對靜止?fàn)顟B(tài)；人乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231、MDA-MB-468、Hs578T、BT-549細(xì)胞表面也高表達(dá)CD44，且CD44與HA結(jié)合活性很強(qiáng)，處于高度活化狀態(tài)，與前人研究結(jié)果相符。以上研究提示，CD44在正常細(xì)胞上多處于靜止?fàn)顟B(tài)，不具有與HA結(jié)合的活性，在腫瘤細(xì)胞上則處于高度活化狀態(tài)，能夠結(jié)合HA。

基于CD44在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面活化狀態(tài)差異，提示腫瘤細(xì)胞表面高度活化的CD44能夠作為理想的靶點(diǎn)分子，用于腫瘤靶向治療。

目前，已有許多學(xué)者以CD44為靶點(diǎn)分子，通過阻斷CD44與HA結(jié)合從而降低腫瘤轉(zhuǎn)移［24-26］，進(jìn)行腫瘤靶向治療。Zawadzki等［27］運(yùn)用CD44s受體蛋白、CD44v10受體蛋白和CD44單克隆抗體阻斷小鼠B16F10黑色素瘤CD44與其配體HA結(jié)合，發(fā)現(xiàn)在不進(jìn)行任何其他處理的情況下，CD44s受體蛋白和CD44v10受體蛋白可使腫瘤在肺部的轉(zhuǎn)移量分別降低70%和60%，CD44單克隆抗體也取得了基本相同的效果。

近年來，隨著納米載藥系統(tǒng)研究的興起，納米顆粒連接靶向分子HA，針對腫瘤表面CD44進(jìn)行腫瘤靶向治療取得很大進(jìn)展。Choi等［28］將HA經(jīng)過疏水性修飾制作成球形HA納米顆粒（HA-NPs），HA-NPs中間為疏水核心，可以運(yùn)載疏水性抗腫瘤藥物，用熒光標(biāo)記HA-NPs，分別作用于高表達(dá)CD44的鱗狀癌細(xì)胞SCC7和正常非洲綠猴腎纖維細(xì)胞CV-1，結(jié)果顯示SCC7可以有效攝取HA-NPs，而CV-1沒有明顯攝取。將SCC7細(xì)胞懸液種入裸鼠背部皮下，構(gòu)建裸鼠鱗癌模型，尾靜脈注射熒光標(biāo)記的HA-NPs檢測其在裸鼠體內(nèi)的靶向性，結(jié)果表明HA-NPs靶向結(jié)合癌細(xì)胞表面CD44，有效提高其腫瘤部位的濃度。Auzenne等［29］發(fā)現(xiàn)HA-PTX對CD44陽性人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3ip和NMP-1的殺傷活性明顯大于單純PTX，加入過量游離的HA能夠阻斷這種增強(qiáng)的殺傷活性，提示HA-PTX通過靶向細(xì)胞表面CD44，達(dá)到增強(qiáng)殺傷靶向細(xì)胞的效果。Rivkin等［30］在PTX脂質(zhì)體上連接HA制得帶靶向性的PTX脂質(zhì)體（PTX-GAGs），為了明確PTX-GAGs是否與腸癌細(xì)胞CT-26高表達(dá)的CD44結(jié)合，將細(xì)胞與PTX-GAGs共孵育0.5、6、12h后，加入CD44單克隆抗體檢測CD44表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.5h時(shí)完全不能檢測到細(xì)胞CD44表達(dá)，6h時(shí)約半數(shù)細(xì)胞可檢測到CD44表達(dá)，12h時(shí)所有細(xì)胞均能檢測到CD44表達(dá)，說明0.5h時(shí)PTX-GAGs與CD44結(jié)合，占據(jù)了CD44全部位點(diǎn)，12h后完全進(jìn)入細(xì)胞，釋放了CD44結(jié)合位點(diǎn)，證實(shí)PTX-GAGs主要依賴與CD44結(jié)合，靶向進(jìn)入細(xì)胞。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也顯示，PTX-GAGs主要集中于腫瘤部位，在同樣的處理?xiàng)l件下，PTX-GAGs抑瘤效果達(dá)市售藥泰素的4倍。這種現(xiàn)象不僅局限于腸癌細(xì)胞，游離多西環(huán)素作用于小鼠肺腺癌細(xì)胞D122 1h，藥物幾乎未進(jìn)入細(xì)胞，不對細(xì)胞造成殺傷，而DOX-GAGs處理1h后，細(xì)胞內(nèi)明顯呈現(xiàn)藥物聚集，說明藥物可以通過CD44與HA靶向結(jié)合主動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，顯著提高細(xì)胞內(nèi)藥物濃度。Bachar等［23］研究了以HA為靶向分子的絲裂霉素脂質(zhì)體（MMC-GAGs）對5例頭頸癌患者的作用，結(jié)果顯示腫瘤組織CD44與HA有很高的結(jié)合活性，而瘤旁正常細(xì)胞CD44基本不結(jié)合HA，體外細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)MMCGAGs選擇性靶向殺傷頭頸癌細(xì)胞，與PTX相比明顯提高殺傷活性，而未殺傷瘤旁正常細(xì)胞，證明MMC-GAGs在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，HA僅與腫瘤細(xì)胞表面CD44結(jié)合，將藥物運(yùn)輸至腫瘤部位，不會殺傷表達(dá)CD44的正常細(xì)胞，在提高藥物療效的同時(shí)也保證了體內(nèi)用藥的安全性。Coradini等［31］將透明質(zhì)酸丁酸納米顆粒（HA-But）分別作用于高表達(dá)CD44的肝癌細(xì)胞HepB3和低表達(dá)CD44的肝癌細(xì)胞HepG2上，發(fā)現(xiàn)HA-But對細(xì)胞的抑制率較單純丁酸提高了10倍左右，在相同條件下HA-But對HepB3的殺傷明顯高于 HepG2，但是充分延長作用時(shí)間HA-But對低表達(dá)CD44的HepG2也有明顯殺傷作用，提示HA-But與CD44結(jié)合后很快進(jìn)入細(xì)胞，CD44可重新結(jié)合HA，保證藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度，抑制腫瘤生長。

以上研究表明，腫瘤細(xì)胞表面活化狀態(tài)的CD44是腫瘤治療的一個(gè)理想靶點(diǎn)，運(yùn)用 HA［26］、CD44單克隆抗體［27］、CD44受體蛋白［27，32］等阻斷CD44與HA的結(jié)合，可以有效減小腫瘤體積，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移；以HA為靶向分子制作藥物靶向CD44能夠有效提高藥物在腫瘤部位的聚集，增加藥物的生物利用度，達(dá)到靶向治療腫瘤的效果。

5 展 望

綜上所述，CD44以不同的狀態(tài)廣泛分布于各類正常和腫瘤細(xì)胞上，特別是活化狀態(tài)的CD44在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，以腫瘤細(xì)胞表面CD44為靶點(diǎn)進(jìn)行腫瘤的靶向治療為腫瘤治療提供了新的方向。但關(guān)于CD44與HA結(jié)合的調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚，有待進(jìn)一步深入地研究。

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