止癢藥物的主要藥效學(xué)研究方法和觀察指標(biāo)

劉 曼，孫亭方，王貴林 （長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北荊州434023）

止癢藥物的主要藥效學(xué)研究是對藥物的止癢作用進(jìn)行實驗性評價，目前最常用的評價方法是在瘙癢動物模型上觀察單位時間內(nèi)的瘙癢次數(shù)及瘙癢潛伏時間等行為學(xué)表現(xiàn)。但瘙癢行為屬主觀指標(biāo)，其單獨應(yīng)用難以客觀評價藥物的止癢效果，常輔以其它指標(biāo)進(jìn)行綜合評價?，F(xiàn)對止癢藥物的藥效學(xué)研究概況作一綜述。

1 瘙癢動物模型的建立

該模型的建立旨在探討?zhàn)W的病理生理機制和研發(fā)止癢藥物，目前瘙癢動物模型主要有3類［1］：①特定種系的自發(fā)瘙癢動物模型。Matsuda等發(fā)現(xiàn)NC／Nga種系小鼠皮損與人類特應(yīng)性皮炎相一致，它可以作為理想的皮炎動物模型用于相關(guān)藥物研究；MRL／lpr種系小鼠因具有嚴(yán)重的自身免疫性疾病而自發(fā)表現(xiàn)出瘙抓行為，它可以作為模擬人類某些自身免疫性疾病伴發(fā)瘙癢癥狀的理想動物模型。②轉(zhuǎn)基因動物瘙癢模型。該模型在研究瘙癢的發(fā)生機制方面應(yīng)用廣泛。③致敏物質(zhì)誘導(dǎo)的瘙癢動物模型。該模型采用單一炎癥介質(zhì) （組胺、5－羥色胺、P物質(zhì)等）或?qū)⑵渑湮榻M合，通過皮內(nèi)或皮下注射引發(fā)動物的瘙抓動作，觀察并記錄單位時間的瘙抓次數(shù)；也可通過多種途徑方式給予化學(xué)物質(zhì) （如化合物48／80、4－氨基吡啶、右旋糖苷40、二硝基氟苯等）進(jìn)行致敏，從而引發(fā)動物的瘙抓動作。后者在誘發(fā)瘙癢的機制和作用效果上優(yōu)于直接使用外源性炎癥介質(zhì)，且更接近臨床，常用于止癢藥物的研究。

2 主要觀測指標(biāo)

2.1 單位時間內(nèi)瘙癢次數(shù)

早在1995年日本富山醫(yī)藥大學(xué)kuraishi博士研究組就已經(jīng)制備出小鼠的瘙癢動物模型［2］，該模型采用皮下、皮內(nèi)或灌胃給藥等方式將致癢物質(zhì)注入實驗動物體內(nèi)，然后觀察記錄各實驗小組小鼠在建模后一段時間的瘙抓行為。Oliveira等［3］分別采用化合物48／80和低分子右旋糖苷40作為致癢劑造模，在頸背側(cè)部位注射化合物48／80，以前、后爪撓鼻子和后爪撓注射部位為瘙癢標(biāo)準(zhǔn)，而注射低分子右旋糖苷40則以除了舔舐動作外瘙抓全身作為一次瘙癢記錄。瘙癢次數(shù)因選擇的致癢劑不同或觀測者的主觀差異性使得瘙癢的標(biāo)準(zhǔn)難于統(tǒng)一。Jiang等［4］學(xué)者在每只實驗小鼠后腿皮下植入小磁石，然后放入1個四周環(huán)繞著圓形線圈的觀察室里觀察，利用小鼠瘙抓時后腿動作產(chǎn)生感應(yīng)電流的原理采用特殊儀器記錄，使觀測過程更簡單、結(jié)果更準(zhǔn)確，但是對小鼠本身會造成一定傷害。新近發(fā)現(xiàn)的SCLABA－Real系統(tǒng)分析方法是一種比較客觀簡易的無創(chuàng)性記錄分析方法，放置在觀察籠頂部的高速數(shù)字圖像采集系統(tǒng)可以同時對4只小鼠的行為進(jìn)行實時記錄分析。實驗結(jié)束后對藥物組、模型組、對照組的瘙癢次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，可采用單因素方差分析法［3］，此法可以消除多組間比較時的抽樣誤差。

2.2 瘙抓反應(yīng)潛伏時間和單次瘙癢持續(xù)時間

采用攝像、計時器等儀器分別對藥物組和對照組造模后出現(xiàn)瘙癢反應(yīng)的潛伏時間以及單次瘙抓持續(xù)時間進(jìn)行記錄，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。這兩個指標(biāo)常結(jié)合單位時間內(nèi)瘙癢次數(shù)綜合評價受試藥物的止癢效果。吳春香等［5］等在研究地膚子醇提取物止癢效果時就使用上述方法和指標(biāo)。

2.3 致癢劑的致癢閾劑量

采用非定量給予致癢劑的方式造模，以致癢劑使用次數(shù)、致癢劑總量等指標(biāo)作為評價指標(biāo)，最常采用磷酸組胺誘導(dǎo)的豚鼠瘙癢模型。王雪蘭等［6］在研究葎草水提取物止癢作用時先將涂藥后的各組豚鼠后肢用細(xì)砂紙輕輕擦傷，使之發(fā)紅，以不出血為度，然后于創(chuàng)面處滴0.25%組胺液，每隔3min滴1次，每次均為0.05ml／只，直至豚鼠出現(xiàn)舔后足為止，將豚鼠首次出現(xiàn)舔右后足時所給予的組胺總量為致癢閾劑量，以各組動物的止癢閾劑量作為評價藥物止癢作用的指標(biāo)。吳春香等［5］采用該研究方法證實地膚子醇提取物的止癢作用；周然等［7］在蛇床子止癢成分R2的一項實驗中也采取涂藥后于后肢備皮處涂抹磷酸組胺，然后每隔3min以磷酸組胺濃度遞增方式給藥直至出現(xiàn)豚鼠回頭舔后足，并計算磷酸組胺的總量作為致癢閾劑量。

2.4 瘙癢介質(zhì)的測定

目前有關(guān)瘙癢發(fā)生的神經(jīng)生理機制尚未完全闡明，但是國內(nèi)外在該領(lǐng)域的研究已經(jīng)取得重大進(jìn)展。據(jù)報道［9］，傳導(dǎo)瘙癢的無髓鞘C纖維廣泛分布于皮膚真皮與表皮，外源性或內(nèi)源性因素作用于機體時可產(chǎn)生相應(yīng)的瘙癢介質(zhì)，后者與神經(jīng)末梢上的特異性受體結(jié)合而產(chǎn)生癢覺神經(jīng)沖動。目前已確定的瘙癢介質(zhì)主要包括胺類、蛋白酶、生長因子、神經(jīng)肽、類阿片物質(zhì)、十二烷類細(xì)胞素等。瘙癢介質(zhì)測定是研究藥物止癢作用的重要指標(biāo)。

2.4.1 胺類介質(zhì) 胺類介質(zhì)主要有組胺和5－羥色胺，組胺是目前研究最多的瘙癢介質(zhì)，組胺在體內(nèi)主要存在于嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞受到免疫性和非免疫因素作用時發(fā)生脫顆粒釋放組胺，后者與游離神經(jīng)末梢上的受體發(fā)生特異結(jié)合而引起癢覺傳導(dǎo)，但是它并不是所有疾病的瘙癢介質(zhì)［9］。致癢劑4－氨基吡啶誘發(fā)小鼠舔體反應(yīng)與刺激肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺有關(guān)［10］，此模型常被應(yīng)用于藥物止癢機制的探討。周然等［7］用此模型研究蛇床子的止癢作用，采用熒光法測定各組動物皮膚和血清樣本的組胺含量，研究結(jié)果顯示藥物組的組胺含量明顯低于對照組并有統(tǒng)計學(xué)意義，證實了蛇床子止癢有效成分的作用機理可能與其穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜、抑制皮膚肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺有關(guān)。

2.4.2 白細(xì)胞介素 業(yè)已證實白細(xì)胞介素IL－2、IL－4、IL－6能引起瘙癢反應(yīng)，在轉(zhuǎn)基因鼠中高表達(dá)IL－4可引發(fā)類似人類特異性皮炎的瘙癢性皮膚?。?，11］。我國學(xué)者王暉等［10］采用組胺和4－氨基吡啶聯(lián)用建立瘙癢動物模型，小鼠眼球取血用試劑盒測定小鼠血清中組胺、INF－γ和IL－6的濃度綜合作為評判模型優(yōu)劣的指標(biāo)之一，結(jié)果表明，瘙癢次數(shù)多的實驗組血清中上述介質(zhì)濃度顯著高于瘙癢次數(shù)少的實驗組。巫冠中等［12］在探討黃酮類活性組分的止癢活性時用氯喹給小鼠全身造模后取各組小鼠血清樣本，用免疫組化方法測定IL－4含量，結(jié)果證實藥物組的IL－4的含量低于模型組，且具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4.3 其它介質(zhì) P物質(zhì)、INF－γ、TNF－α等亦可作為瘙癢介質(zhì)。P物質(zhì)是一種含11個氨基酸殘基的多聚肽，屬于速激肽家族，存在于神經(jīng)末梢纖維內(nèi)，與NK－1受體結(jié)合而引起癢覺傳導(dǎo)。多位學(xué)者［13－15］曾報道，在變應(yīng)性接觸性皮炎 （ACD）伴發(fā)的瘙癢機制研究中組胺和5－羥色胺可能不起主要作用，P物質(zhì)通過與神經(jīng)肽受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。在其它類型瘙癢中，C類神經(jīng)被激活后可導(dǎo)致神經(jīng)肽P物質(zhì)的釋放，后者加速肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺。

2.5 病理形態(tài)學(xué)檢查

在瘙癢動物模型觀察瘙癢行為之后，立即剪取模型小鼠注射致癢劑周圍2cm×2cm大小面積的皮膚，初步去除皮下結(jié)締組織，放入10%的甲醛溶液中固定保存，然后制成常規(guī)病理切片。瘙癢反應(yīng)的病理學(xué)改變主要有：局部毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞收縮，毛細(xì)血管通透性增加以及炎性成分的滲出，炎性細(xì)胞的聚集、增生與浸潤。

王暉［10］采用組胺和4－氨基吡啶聯(lián)用建立瘙癢動物模型，在該模型動物皮膚樣本中發(fā)現(xiàn)以中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞分布更密集，間質(zhì)水腫更明顯，結(jié)合瘙癢反應(yīng)次數(shù)及致癢介質(zhì)濃度測定結(jié)果綜合判斷，表明聯(lián)合方案建立的動物模型瘙癢行為更明顯。

巫冠中［12］研黃銅類止癢活性，探討該藥物抑制肥大細(xì)胞脫顆粒和組胺釋放的作用。選用SD小鼠作為實驗動物，經(jīng)腹腔灌洗收集肥大細(xì)胞，并按相應(yīng)的細(xì)胞生物學(xué)方法經(jīng)系列處理得到濃縮的單層細(xì)胞液，隨機收取100個細(xì)胞用1%中性紅溶液染色，計數(shù)其中脫顆粒的肥大細(xì)胞。評判的標(biāo)準(zhǔn)包括細(xì)胞邊緣的完整性消失；細(xì)胞顆粒狀物的釋放。

3 超敏反應(yīng)動物模型在止癢藥物研究中的應(yīng)用

超敏反應(yīng)動物模型的炎癥反應(yīng)程度可用于評價藥物止癢效果，在超敏反應(yīng)動物模型上測定藥物組與對照組的局部腫脹度或單位面積重量作為評價指標(biāo)。周然等［7］將實驗組涂藥、對照組涂賦形劑后用DNCB（2、4－二硝基氯苯）引發(fā)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)，各組小鼠以1%DNCB（空白對照組用乙醇）0.1ml均勻涂于脫毛區(qū)皮膚致敏，次日起各組背部脫毛區(qū)涂抹相應(yīng)的藥物，1次／d，連續(xù)5d，于致敏后第5天，各組小鼠以1%DNCB 0.1ml均勻涂于右耳內(nèi)外兩側(cè)以激發(fā)，24h后脫臼處死，用打孔器取下兩耳相同部位相同面積的耳片稱重，以左右耳片重量差值為腫脹度，計算出腫脹率，統(tǒng)計結(jié)果表明給藥組的腫脹率明顯低于對照組。王雪蘭［6］亦采用該方法探討葎草水提取物的止癢效果。

4 小結(jié)與展望

止癢藥物藥理作用在動物實驗研究階段常以瘙癢行為為主要甚至為唯一指標(biāo)。但在動物瘙癢行為的觀察上因瘙癢行為的標(biāo)準(zhǔn)難于統(tǒng)一導(dǎo)致主觀上的誤差，同時也有客觀上的誤差，如以小鼠為實驗動物對象，小鼠在安靜無刺激因素的狀態(tài)下出現(xiàn)自發(fā)性的瘙癢行為動作也較常見［15］。甚至有的學(xué)者建立的動物模型本身就不能很好的模擬人類的瘙癢癥狀［1］，kuraishi經(jīng)典的瘙癢模型就不能很好的區(qū)分疼痛和瘙癢引起的瘙抓動作［16］。我們總結(jié)了評價藥物止癢效果的常用方法與指標(biāo)，具體使用時應(yīng)以瘙癢動物模型的瘙癢行為記錄為基礎(chǔ)，再聯(lián)用其它方法與指標(biāo)。鑒于瘙癢往往是多因素引起的多種瘙癢介質(zhì)參與的病理癥狀，有學(xué)者在建立瘙癢動物模型時同時采用幾種致癢物質(zhì)建立動物模型而非單一物質(zhì)制造的動物模型似乎更合理［10］。