GDNF在慢性應(yīng)激和老化致小鼠行為與認(rèn)知損傷中的作用*

李 亞，張亞楠，陳亞靜，張冠雄，史建勛

（曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東曲阜273165）

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中主要成員之一，對神經(jīng)元的生長、增殖、分化、凋亡及軸突的形成等方面具有重要的作用［1］。GDNF在發(fā)育期和成年動物的皮層、海馬、紋狀體及脊髓中均有廣泛分布；在不同的發(fā)育階段以及腦內(nèi)不同部位，GDNF的作用也不盡相同。有研究報(bào)道，將人胚胎的神經(jīng)干細(xì)胞植入外傷性腦損傷的大鼠受損海馬部位，可引起大量GDNF表達(dá)和釋放，并明顯改善其認(rèn)知功能［2］。

在腦內(nèi)，海馬和前額葉是最易受應(yīng)激刺激損傷的腦區(qū)，也是與學(xué)習(xí)記憶功能關(guān)系密切的重要區(qū)域［3］。研究表明，動物接受強(qiáng)烈的急性應(yīng)激或長期的慢性應(yīng)激時(shí)，其學(xué)習(xí)記憶能力顯著損傷［4］。本研究采用多因素慢性應(yīng)激動物模型，檢測不同月齡小鼠的曠場行為和空間學(xué)習(xí)記憶功能的變化，測定不同月齡小鼠腦內(nèi)海馬和前腦皮層神經(jīng)元GDNF的表達(dá)，以探討慢性應(yīng)激對小鼠曠場行為和空間學(xué)習(xí)記憶功能的影響及腦內(nèi)GDNF的作用。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物和分組

健康昆明品系小白鼠2月齡（青年，體重20～22 g）和 15月齡（老年，體重 40～60 g），清潔級，雌雄各半，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司動物實(shí)驗(yàn)中心提供。將青年和老年小鼠隨機(jī)分為對照組和應(yīng)激組。應(yīng)激組小鼠共接受21 d不同的慢性應(yīng)激源。采用五種應(yīng)激方式：足底電擊（電壓33 V，每隔1 min刺激一次，每次持續(xù) 10 s，共 15次）、束縛（1 h／d）、束縛＋熱刺激（1 h／d，30℃）、冷水刺激（6℃冷水游泳 3 min）、高臺（1 h／d，高 1．6 m）。每天隨機(jī)選擇一種應(yīng)激方式施加于應(yīng)激組小鼠。對照組小鼠不接受慢性應(yīng)激源，以同樣的條件飼養(yǎng)。在慢性應(yīng)激后，對應(yīng)激組和對照組小鼠進(jìn)行曠場行為測試和Morris水迷宮試驗(yàn)，并檢測小鼠前腦皮層和海馬神經(jīng)元GDNF的表達(dá)。

1．2 曠場行為（Open field behavior）檢測

曠場行為測試箱高40 cm，底面為50 cm×50 cm的正方形，被均等分成5×5＝25個(gè)方格，測試箱上方放置一個(gè)60 W的燈光，距離測試箱頂60 cm。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將動物放在中央格內(nèi)，記錄5 min內(nèi)小鼠跑動的爬行格數(shù)（四爪進(jìn)入的方格數(shù)）、直立次數(shù)（兩前爪騰空或攀附箱壁）、修飾次數(shù)（洗臉、抓癢、舔足的次數(shù)）和中央格首次停留時(shí)間（小鼠被放入中央格直至其四爪跨出該格的時(shí)間）。行為評定采用單盲法。

1．3 Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力檢測

Morris水迷宮試驗(yàn)程序包括定位航行（Place navigation）和空間搜索（Spatial probe）兩部分。水迷宮被均等的分為4個(gè)象限，平臺置于第Ⅰ象限（目標(biāo)象限），在水池第Ⅲ象限周邊壁上做明顯標(biāo)志物。定位航行試驗(yàn)歷時(shí)2 d，每只小鼠每天接受8次找平臺訓(xùn)練，分兩個(gè)訓(xùn)練周期（上午和下午），每個(gè)訓(xùn)練周期4次，每次對應(yīng)一個(gè)象限將小鼠面向池壁入水，每次訓(xùn)練2 min。記錄小鼠尋找到隱藏在水下平臺的時(shí)間即逃避潛伏期（escape latency）?？臻g搜索試驗(yàn)在第3天進(jìn)行，撤除平臺，從第Ⅲ象限將小鼠放入水中，記錄120 s內(nèi)小鼠在四個(gè)象限的游泳（停留）時(shí)間，檢測小鼠對原平臺（目標(biāo)象限）的記憶保持能力。

1．4 小鼠海馬和前腦皮層GDNF的表達(dá)

水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后，戊巴比妥鈉（0．4%）麻醉小鼠，暴露心臟，經(jīng)心快速灌注生理鹽水和預(yù)冷的多聚甲醛溶液，前固定；取腦，后固定2 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋后，連續(xù)冠狀切片（片厚5μm）。切片脫蠟至水，3%過氧化氫水溶液去除內(nèi)源性酶，98℃抗原修復(fù)10 min，免疫組織化學(xué)染色按SABC試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）操作說明進(jìn)行，采用兔抗小鼠GDNF多克隆抗體（編號BA0890），以PBS（磷酸鹽緩沖液）代替一抗作陰性對照。每只小鼠選擇腦海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、齒狀回（DG）和前腦皮層（PFC）切片4張，每片隨機(jī)選取各區(qū)視野，進(jìn)行顯微（×400）拍照。采用Motic Images Advanced 3．2圖像處理系統(tǒng)分析測量GDNF的陽性神經(jīng)元數(shù)目。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 13．0軟件，水迷宮定位航行試驗(yàn)中的逃避潛伏期進(jìn)行雙因素重復(fù)測量的方差分析（repeated-measures ANOVA）；空間搜索試驗(yàn)中各象限游泳時(shí)間進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較采用Dunnett′s t檢驗(yàn)或非配對t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 不同月齡小鼠曠場行為的變化

分別與其對照組比較，青年應(yīng)激組小鼠的爬行格數(shù)、直立次數(shù)、修飾次數(shù)均明顯減少（P＜0．05，P＜0．01），而中央格首次停留時(shí)間顯著增多（P＜0．01）；在老年應(yīng)激組小鼠，爬行格數(shù)、直立次數(shù)、修飾次數(shù)顯著減少（P＜0．05，P＜0．01），中央格首次停留時(shí)間明顯增多（P＜0．05）。

青年與老年小鼠比較結(jié)果顯示，老年對照小鼠的爬行格數(shù)、直立次數(shù)明顯減少（P＜0．05，P＜0．01），中央格首次停留時(shí)間明顯增多（P＜0．05）；老年應(yīng)激小鼠的爬行格數(shù)和中央格首次停留時(shí)間有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（P＜0．05）。結(jié)果表明，老年小鼠在新異環(huán)境中的自發(fā)活動和探究行為的減少，而慢性應(yīng)激可引起小鼠自發(fā)活動和探究行為明顯降低（表 1）。

Tab．1 Open field behavior of different ages mice after chronic stress（±s，n＝10）

Tab．1 Open field behavior of different ages mice after chronic stress（±s，n＝10）

*P＜0．05，**P＜0．01 vs control；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01 vs young mice control；△P＜0．05 vs young mice stress

Group Locomotion Rearing Grooming First residence time（s ）Young mice Control 133．30±11．26 36．19±3．06 7．17±1．53 0．96±0．07 Stress 85．23±10．32* 14．67±2．07** 3．62±1．23* 8．63±1．86**Aged mice Control 117．50±10．65＃ 18．56±3．45＃＃ 4．88±1．24 4．17±0．63＃Stress 68．53±9．56**△ 7．17±2．46** 2．16±0．43* 20．50±4．54*△

2．2 不同月齡小鼠定位航行學(xué)習(xí)能力的變化

重復(fù)測量方差分析結(jié)果表明，經(jīng)過2 d的定位航行學(xué)習(xí)，青年和老年各組小鼠尋找水下平臺所需的逃避潛伏期均隨時(shí)間變化而縮短（圖1）；與訓(xùn)練周期（training period）1比較，青年對照組小鼠的逃避潛伏期第2、3、4訓(xùn)練周期顯著縮短（均 P＜0．01）；老年對照組小鼠的逃避潛伏期僅在第3、4訓(xùn)練周期明顯縮短（均 P＜0．01）。組間比較結(jié)果顯示，與青年對照組比較，青年應(yīng)激組小鼠第2、3、4訓(xùn)練周期的逃避潛伏期均有顯著性差異（均 P＜0．01）；與老年對照組比較，老年應(yīng)激組小鼠在第3、4訓(xùn)練周期的逃避潛伏期明顯增加（P＜0．05，P＜0．01）。老年對照組與青年對照組相比，在第1、2訓(xùn)練周期的逃避潛伏期有顯著性差異（P＜0．05，P＜0．01）；而老年應(yīng)激組小鼠在第1、3訓(xùn)練周期的逃避潛伏期，與青年應(yīng)激組比較明顯增加（均 P＜0．05）。表明老年小鼠空間學(xué)習(xí)能力下降；而慢性應(yīng)激可導(dǎo)致小鼠的空間學(xué)習(xí)能力明顯減退。

Fig．1 Escape latency of different ages mice after chronic stress（±s，n＝10）**P＜0．01 vs training period 1；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01 vs control；P＜0．05P＜0．01 vs young mice control；▲P＜0．05 vs young mice stress

2．3 不同月齡小鼠空間搜索能力的變化

在第3天的空間搜索試驗(yàn)中，青年和老年各組小鼠均在目標(biāo)象限（第Ⅰ象限）停留的時(shí)間最長（圖2）。青年對照組和老年對照組小鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間顯著長于在其它三個(gè)象限的時(shí)間（均 P＜0．01）；而青年應(yīng)激組和老年應(yīng)激組小鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（均 P＞0．05）。組間比較結(jié)果顯示，在青年小鼠，與對照組比較，應(yīng)激組小鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間顯著縮短（P＜0．01）；老年對照組與老年應(yīng)激組小鼠比較，在目標(biāo)象限的停留時(shí)間亦有顯著性差異（P＜0．05）。老年對照組與青年對照組相比，在目標(biāo)象限停留的時(shí)間顯著縮短（P＜0．05）。結(jié)果說明，老年小鼠空間記憶能力減退；而慢性應(yīng)激明顯損傷小鼠的空間記憶保持能力。

Fig．2 Swimming time of different ages mice in four quadrants after chronic stress（x±s，n＝10）**P＜0．01 vs quadrantⅠ（target quadrant）；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01 vs control；△P＜0．05 vs young mice control

2．4 不同月齡小鼠腦內(nèi)GDNF的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，在青年和老年小鼠腦內(nèi)海馬的CA1區(qū)、CA3區(qū)錐體細(xì)胞層、DG區(qū)顆粒細(xì)胞層和前腦皮層，GDNF陽性神經(jīng)元都有廣泛分布。在青年小鼠，與對照組比較（表2），應(yīng)激組小鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)與前腦皮層的GDNF陽性神經(jīng)元數(shù)目顯著減少（P＜0．05，P＜0．01）；在老年小鼠，與對照組比較，應(yīng)激組小鼠各個(gè)腦區(qū)的GDNF陽性神經(jīng)元數(shù)亦顯著減少（P＜0．05，P＜0．01）；青年對照組和老年對照組小鼠各腦區(qū)GDNF表達(dá)的比較結(jié)果顯示，老年對照組小鼠僅在CA3、DG區(qū)和前腦皮層明顯減少（P＜0．05，P＜0．01）；而老年應(yīng)激組小鼠GDNF表達(dá)的降低更加顯著。結(jié)果表明，老年小鼠腦海馬和前腦皮層GDNF的表達(dá)降低；而慢性應(yīng)激后腦內(nèi)海馬各區(qū)和前腦皮層GDNF的表達(dá)顯著降低。

Tab．2 Numbers of GDNF positive neurons of different ages mice brain after chronic stress（x±s，n＝10）

Tab．2 Numbers of GDNF positive neurons of different ages mice brain after chronic stress（x±s，n＝10）

*P＜0．05，**P＜0．01 vs control；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01 vs young mice control；△P＜0．05，△△P＜0．01 vs young mice stress

Group CA1 CA3 DG PFC Young mice control 47．12±3．65 60．12±4．23 132．10±7．86 103．58±4．35 Stress 32．23±2．86* 45．78±3．76* 106．64±6．12* 89．02±3．21**Aged mice control 49．26±4．28 51．42±5．23＃ 73．06±5．38＃＃ 92．46±4．26＃Stress 25．58±3．64** 30．13±3．14*△ 53．65±4．21*△△ 48．86±3．27**△

3 討論

有研究報(bào)道，多因素的慢性應(yīng)激，可引起動物腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)激素和下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的改變，導(dǎo)致動物行為和學(xué)習(xí)記憶功能的損害。慢性應(yīng)激或長期外源性應(yīng)激激素（糖皮質(zhì)激素）處理可以引起機(jī)體神經(jīng)精神系統(tǒng)功能失調(diào)，導(dǎo)致衰老過程加速，出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙、癡呆、抑郁等病癥［5］，其中對前額葉和海馬的選擇性損傷是導(dǎo)致這些疾患發(fā)生的關(guān)鍵原因。我們先前的研究顯示，多因素慢性應(yīng)激可引起大鼠在曠場行為中的活動減少，并且明顯損傷動物的空間學(xué)習(xí)記憶功能。但亦有慢性復(fù)合性應(yīng)激可增強(qiáng)大鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力的報(bào)道；這可能與應(yīng)激刺激的類型和持續(xù)時(shí)間等因素不同有關(guān)。

海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū)［6］，也是調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)并受應(yīng)激影響的重要的腦部結(jié)構(gòu)之一。慢性應(yīng)激對海馬介導(dǎo)的記憶有持久性損傷作用，可能是通過改變海馬突觸可塑性而影響動物的學(xué)習(xí)記憶過程［7］。在腦內(nèi)，應(yīng)激因素除對海馬有影響外，對其它腦區(qū)，如前額葉、杏仁核等也有作用［8］。不同應(yīng)激源可引起機(jī)體產(chǎn)生許多與前額葉功能紊亂的神經(jīng)精神疾??；明顯損害大鼠、猴的依賴前額葉的工作記憶能力［9］。本研究結(jié)果表明，慢性應(yīng)激導(dǎo)致小鼠在新異環(huán)境中自發(fā)活動和探究行為明顯減少，空間學(xué)習(xí)記憶能力顯著受損；而老年小鼠的損傷更嚴(yán)重。

GDNF來源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是一種在體內(nèi)有廣泛表達(dá)并且作用復(fù)雜的多效能神經(jīng)營養(yǎng)因子，其生物學(xué)效應(yīng)及作用機(jī)制倍受關(guān)注。GDNF對由各種原因造成的神經(jīng)元損傷均有保護(hù)和修復(fù)作用。有研究顯示，GDNF及其受體在海馬和前額葉皮質(zhì)都有高度表達(dá)，已經(jīng)明確這些腦區(qū)與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)。GDNF基因敲除小鼠表現(xiàn)出海馬突觸傳遞效能異常，水迷宮學(xué)習(xí)任務(wù)明顯受損。GDNF可使老齡鼠隔-海馬系統(tǒng)的膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶（ChAT）活性增加，該酶與空間學(xué)習(xí)能力密切相關(guān)，而腦室內(nèi)注射GDNF，可顯著改善老齡鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。GDNF亦可顯著提高老年大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力［10］。另有研究表明，GDNF和 GDNF受體（GFR-α1）mRNA的表達(dá)水平在出生后隨年齡的增長而下降，具有增齡性變化，提示GDNF的變化可能影響神經(jīng)前體細(xì)胞的發(fā)育、分化及隨年齡的增加而產(chǎn)生的腦老化過程。新生大鼠的海馬GDNF mRNA的表達(dá)明顯上升，生后呈下降趨勢。可以推測，衰老過程中較早出現(xiàn)的學(xué)習(xí)記憶功能的減退與此密切相關(guān)；GDNF不但與神經(jīng)發(fā)育、分化有關(guān)，也可能參與腦的老化過程。

本研究結(jié)果顯示，慢性應(yīng)激后小鼠海馬CA1、CA3區(qū)、齒狀回和前腦皮層GDNF陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少。結(jié)果表明，隨著年齡的增大，小鼠腦內(nèi)海馬及前腦皮層神經(jīng)元GDNF表達(dá)明顯減少；而慢性應(yīng)激可導(dǎo)致小鼠海馬及前腦皮層神經(jīng)元GDNF的表達(dá)顯著降低，老年小鼠的改變加重。本研究結(jié)果提示，腦的老化和慢性應(yīng)激導(dǎo)致的小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的損傷可能與海馬及前腦皮層神經(jīng)元GDNF表達(dá)的變化密切相關(guān)。

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