地塞米松對大鼠腦出血后血腫周圍組織IL-8表達的影響

張學敏，馬風杰，丁緒平，李 芳，趙玉嬌

腦出血（ICH）為原發(fā)性非外傷性腦實質內出血，為中老年人的常見病、多發(fā)病，其致殘率和死亡率均較高，給社會、家庭帶來沉重的經濟負擔。其預后除了與出血量、出血部位有關外，也與血腫周圍遲發(fā)性腦水腫引起的神經細胞死亡密切相關。近幾年研究發(fā)現腦出血后血腫周圍的炎癥反應參與局部水腫的形成［1，2］，因此從血腫周圍水腫帶形成機制的角度來治療腦出血備受關注。本研究通過地塞米松對大鼠腦出血血腫周圍組織白介素-8（IL-8）表達的影響，探討地塞米松對腦出血大鼠的神經保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性Wister大鼠72只，體重250 g～350 g，購自濰坊醫(yī)學院實驗動物中心。

1.2 儀器與試劑 IL-8抗體（北京博奧森生物技術有限公司），二抗及DAB顯色劑（北京中杉金橋生物技術有限公司），地塞米松，10%水合氯醛，75%酒精，雙氧水，生理鹽水，多聚甲醛，5 m L注射器，立體定位儀（ZH-藍星 淮北正華設備有限公司）微量注射器，手術器械一套。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 將72只大鼠隨機分為4組，每組18只，即假手術組、模型組、高劑量組、低劑量組，每組按取腦時間分為12 h、24 h、3 d，每個時間點6只。低劑量組從造模成功后至處死前每天腹腔注射地塞米松（0.5 mg／kg），高劑量組給予地塞米松（1.0 mg／kg），每日1次。模型組、假手術組均于相同時限腹腔注射等容量的生理鹽水。

1.3.2 模型制備 采取自體血注入法制備大鼠腦出血模型。術前大鼠禁食12 h，不禁水。10%水合氯醛4 m L／kg腹腔麻醉，檢查睫毛反射減弱、捏耳無反應時，將大鼠頭部固定立體定向儀，局部備皮，75%乙醇消毒局部皮膚，行頂部正中切口，以雙氧水腐蝕局部骨膜，暴露前囟，以前囟中央為中心原點，在原點后1.8 mm、右側4 mm，用5 m L注射器針頭鉆孔，用微量注射器插入顱骨表面下5 mm內囊處緩慢注入50μL自體血（斷尾取血），留針5 min后緩慢將針退出，然后消毒局部加入青霉素粉并縫合皮膚，回籠飼養(yǎng)模型制備完畢。模型組術后立即給予注射生理鹽水1.0 mL。高、低劑量組分別給予1.0 mg／kg、0.5 mg／kg地塞米松。

1.3.3 模型制備成功的標準 大鼠清醒后，無神經功能缺失、意識喪失、死亡的大鼠剔除，據Berderson等的評分標準分為三級。Ⅰ級：將大鼠尾巴提起來，癱瘓側前肢回收后屈曲于腹下，正常側前肢向地面伸展；Ⅱ級：除以上體征外，向癱瘓側推大鼠時阻力較對側明顯降低；Ⅲ級：除以上癥狀外，大鼠有向患側側旋的行為。出現以上癥狀為造模成功。

1.3.4 標本收集與檢測 大鼠在出血后的各個時間點以10%水合氯醛腹腔麻醉，開胸暴露心臟，在心尖部剪開一約2 mm小口，將穿刺針自切口插入心臟并送至主動脈口處固定，37℃生理鹽水200 mL灌洗；然后以40 g／L多聚甲醛溶液500 m L灌注內固定后斷頭取腦，將標本置40 g／L多聚甲醛溶液中后固定約24 h，取血腫周圍腦組織，常規(guī)石蠟包埋，切片，制片后進行HE染色觀察血腫周圍組織的炎癥反應情況；免疫組化染色觀察IL-8的表達，IL-8免疫組化陽性表達均為細胞膜和細胞漿呈棕黃色。計數方法：每張切片取5個高倍鏡視野，計數5個高倍視野內的陽性細胞總數，計算每高倍視野下陽性細胞均數。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數據處理。實驗數據用均數±標準差±s）表示，兩組間比較采用兩樣本均數t檢驗（方差不齊采用成組設計兩樣本比較的秩和檢驗）。

2 結 果

2.1 免疫組化染色 腦出血后血腫周圍有明顯的炎癥細胞聚集，主要以單核巨噬細胞為主。

2.2 腦出血后血腫周圍組織IL-8表達的動態(tài)變化 假手術組針道周圍有少量IL-8表達，但無明顯時間變化；模型組與治療組血腫周圍IL-8的表達在12 h升高，24 h達高峰，3 d開始下降，與假手術組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；主要在血管周圍內皮細胞、神經膠質細胞的胞漿及胞核內表達。詳見表1。

2.3 地塞米松對大鼠腦出血后血腫周圍IL-8表達的影響治療組與模型組比較各個時間點IL-8的表達均下降（P＜0.05）；高劑量組各個時間點IL-8的表達較低劑量組下降明顯（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組血腫周圍組織IL-8表達的比較±s） 個／視野

表1 各組血腫周圍組織IL-8表達的比較±s） 個／視野

組別12 h 24 h 3 d假手術組0.46±0.03 0.47±0.03 0.50±0.03模型組 0.52±0.03 7.20±0.31 5.32±0.37低劑量組 0.44±0.301） 5.84±0.141） 4.74±0.381）高劑量組 0.36±0.051）2） 3.55±0.261）2） 3.03±0.181）2）與模型組同一時間點比較，1）P＜0.05；與低劑量組比較，2）P＜0.05

3 討 論

腦出血是嚴重危害人類生命健康的疾病，目前對腦出血尚無明確有效的治療方法。臨床上將甘露醇作為急性腦出血發(fā)病早期抗水腫的藥物，早在1989年WHO就報道急性腦出血應用甘露醇易加重病情［3］，甘露醇在局部血腦屏障破壞后，可滲透至血管外腦組織間隙內，從而使局部滲透壓升高，導致全身脫水而局部腦水腫反而加劇，形成所謂的“反跳現象”［4］，因此這類藥物對于治療腦出血有其局限性。止血劑應用的安全性和有效性也有待進一步觀察，因此從血腫周圍水腫帶形成機制的角度來治療腦出血備受關注。目前大量實驗研究已經表明，腦出血后血腫內和血腫周圍存在明顯的炎癥反應，潘新發(fā)等［5］列舉了多種炎癥細胞及炎癥因子，并詳細闡述了它們在其中發(fā)揮的不同角色，最終導致局部腦組織血流的下降、周圍組織水腫的加重。

細胞因子是一類具有廣泛生物活性的小分子蛋白質，大部分是在細胞間發(fā)揮信號傳導的作用，與機體免疫反應、代謝、炎癥反應及組織修復關系密切。近年來的深入研究表明，細胞因子在腦出血后血腫周圍組織水腫的形成中有著重要的作用，其中IL-8就是一種在炎癥早期發(fā)揮重要作用的細胞因子，主要由激活的單核巨噬細胞產生；其他如內皮細胞、成纖維細胞、上皮細胞、肝細胞等亦可在適宜的刺激條件下產生。IL-8可單獨或共同協同其他炎性因子通過介導或直接、間接參與炎癥反應導致內皮功能的異常［6］。王懷立等［7］通過應用脂多糖建立的腦水腫動物模型也證實IL-8參與腦組織含水量的增加和血腦屏障的破壞過程，是造成腦水腫發(fā)生的重要細胞因子之一。Yamasaki等［8］發(fā)現IL-8能促進白細胞浸潤、聚集、細胞黏附和產生大量自由基并促進脂質過氧化和細胞因子的釋放失調，導致腦毛細血管內皮細胞及基底膜損害，誘發(fā)血管源性水腫的發(fā)生和神經元損傷。Mukaida等［9］報道應用IL-8單克隆抗體或阻斷IL-8釋放可明顯減輕炎性反應，阻止白細胞浸潤，這些研究表明IL-8在腦出血中起著重要作用。

當處于明顯的應激狀態(tài)時，機體可釋放大量糖皮質激素，超生理劑量時有強大的抗炎作用。地塞米松作為一種糖皮質激素，可以穩(wěn)定細胞膜和溶酶體的活性，減輕氧自由基對局部組織損傷的反應，抑制磷脂酶，使炎性介質、血管活性物質生成減少，同時還可降低血腦屏障的通透性，增加局部大腦的血流量，改善缺血，從而減輕腦水腫，可以從炎癥反應的角度治療腦出血［10］。本研究就是從腦出血后血腫周圍水腫帶形成機制的角度來治療腦出血，減輕局部腦水腫，改善腦出血預后，但對于地塞米松最終能否延長大鼠生命及其產生的副反應還有待進一步研究。

［1］ Gong C，Hof JT，Keep RF.Acute inflammatory reaction following experimental intracerebral hemorrhage in rat［J］.Brain Res，2000，871（1）：57-65.

［2］ Xue M，Del Biqio MR.Intracerebral injection of autologous whole blood in rats：Time course of inflammation and cell death［J］.Neurosci Lett，2000，283（3）：230-232.

［3］ 郭玉璞，王文志，李允德.中國腦血管病治療專家論集［J］.沈陽：沈陽出版社，1995：34-43；80；137-142.

［4］ Nau R.Osmotherapy for elevated intracranial pressure：A critical reappraisal［J］.Clin Pharmacokinet，2000，38（1）：23-40.

［5］ 潘新發(fā)，萬曙，詹仁雅.腦出血后血腫周圍組織炎癥反應的研究新進展［J］.國際神經病學神經外科學雜志，2010，37（3）：263-266.

［6］ 孔麗，胡云龍，趙三江，等.原發(fā)性肝癌患者血清TGF-β1和IL-8水平與預后的關系［J］.天津醫(yī)學，2005，3（12）：75-41.

［7］ 王懷立，高東培，蘆軍萍，等.TNF-α、IL-8在脂多糖致大鼠腦水腫中的表達［J］.免疫學雜志，2002，18（6）：440-446.

［8］ Yamasaki Y，Matsuo Y，Matsuura N，et al.Transient increase of cytokine-induced neutrophil chemoattractant，a member of the interleukin-8 family，in ischemic brain areas after focal ischemia in rats［J］.Stroke，1995，26（2）：318-322.

［9］ Mukaida N，Matsumoto T，Yokoi K，et al.Inhibition of neutrophil-mediated acute inflammation injury by an antibody against interleukin-8（IL-8）［J］.Inflamm Res，1998，47（Suppl3）：151-157.

［10］ 徐侯寶.大劑量激素作用的受體機制以及危重病人激素治療的新策略［J］.外科理論與實踐，2000，5（2）：76-78.