實(shí)驗(yàn)犬放射性心臟損傷模型建立與評(píng)價(jià)1）

宋建波，閆 蕊，侯彥杰，張國(guó)良，鄢 敏，李思進(jìn)

放射性心臟損傷（Radiation induced heart disease，RIHD）是由胸部腫瘤放療引起的遲發(fā)性不良反應(yīng)之一。20世紀(jì)90年代臨床回顧研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌和霍奇金淋巴瘤等惡性腫瘤患者放療后心臟病病死率明顯高于正常人，這一問(wèn)題逐漸引起放療專家廣泛關(guān)注［1，2］。以往文獻(xiàn)報(bào)道的動(dòng)物模型大多采用小鼠、大鼠或兔子等，本研究選用實(shí)驗(yàn)犬作為研究對(duì)象，由于其心臟解剖結(jié)構(gòu)與人相似，不容易死亡，并可以行影像學(xué)檢查等特點(diǎn)，可為后續(xù)研究提供穩(wěn)定可靠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物處理 取健康成年雄性1歲齡比格犬8只，體重（12.00±0.67）kg，安徽省阜陽(yáng)市維光實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，中國(guó)輻射防護(hù)院動(dòng)物中心對(duì)實(shí)驗(yàn)犬標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)，試驗(yàn)中所有麻醉劑均使用戊巴比妥鈉。

1.2 PET／CT代謝顯像方法 顯像劑18F-FDG由住友加速器（HM-10）全自動(dòng)化合成，產(chǎn)物經(jīng)過(guò) HPLC分析，放化純＞95%可以使用。實(shí)驗(yàn)犬禁食12 h后經(jīng)靜脈推注50%葡萄糖（1 g／kg），半小時(shí)后麻醉并靜脈注射222 MBq 18F-FDG，靜息45 min后行PET-CT顯像（GE Discovery VCT）。首先以CT Scout像定位心臟，并以心臟為中心掃描，先行CT掃描，然后使用3D心電門控模式數(shù)據(jù)采集，矩陣128×128，采集時(shí)間約為10 min。之后1周行心肌照射，照射后3個(gè)月以上述相同方法行18FFDG顯像。

1.3 照射方法 實(shí)驗(yàn)犬麻醉后取仰臥位真空墊體位固定，增強(qiáng)CT模擬定位掃描（GE Discovery VCT），照射結(jié)束后將圖像傳至Varian eclipse TPS系統(tǒng)，勾畫(huà)左室前壁作為照射靶區(qū)，靶區(qū)約占左室室壁體積的1／4～1／3，制定調(diào)強(qiáng)放療計(jì)劃，照射劑量為單次20Gy。計(jì)劃設(shè)計(jì)完成后，實(shí)驗(yàn)犬以模擬掃描相同體位在直線加速器（Varian Clinac IX）上進(jìn)行擺位固定，錐形束CT（CBCT）掃描進(jìn)行位置驗(yàn)證，位置驗(yàn)證合格后執(zhí)行照射，射線能量為6MV-X線。

1.4 圖像處理和分析 使用同機(jī)CT數(shù)據(jù)對(duì)PET圖像進(jìn)行衰減校正、圖像重建和融合后將數(shù)據(jù)傳至Xeleris 4.3工作站進(jìn)行圖像分析，結(jié)果判斷由兩位有經(jīng)驗(yàn)的核醫(yī)學(xué)醫(yī)師雙盲法閱片，比較照射前后心肌代謝變化情況。分別在前壁照射區(qū)和側(cè)壁、間壁非照射區(qū)勾畫(huà)感興趣區(qū)（ROI）并測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化攝取值（SUV），做放療前后照射區(qū)／非照射區(qū)（SUVig／SUVnig）定量分析。

1.5 病理學(xué)檢查 常規(guī)麻醉后用10%KCl 5 m L心腔直接注射處死動(dòng)物，肉眼觀察心肌變化情況，取照射區(qū)與非照射區(qū)心肌浸于3.7%福爾馬林液中，擇期石蠟包埋切片病理觀察心肌血管損傷情況，行HE染色，用光學(xué)顯微鏡以不同倍數(shù)觀察。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 8只比格犬均完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，放療前后飲食、體重、毛發(fā)色澤及精神狀態(tài)無(wú)明顯變化。放射治療過(guò)程順利，在線CBCT分析誤差均未超過(guò)5 mm。

2.2 心肌18F-FDG代謝情況

2.2.1 圖像分析 放療前8只比格犬心肌攝取18F-FDG均勻清晰，未觀察到明顯放射性攝取增高減低區(qū)。放療后3個(gè)月心臟攝取18F-FDG不均勻，左心室前壁及心尖部放射性節(jié)段性攝取增高，水平軸重建并與CT融合后可觀察到與放射靶區(qū)一致的攝取增高區(qū)。

2.2.2 SUVig／SUVnig定量分析 照射后實(shí)驗(yàn)犬左心室前壁和心尖照射區(qū)標(biāo)準(zhǔn)化攝取比值均大于照射前，照射前后SUV比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。詳見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)犬照射前后SUVig／SUVnig比值

2.3 病理學(xué)結(jié)果 處死實(shí)驗(yàn)犬暴露心臟后肉眼觀察，8只實(shí)驗(yàn)犬均可見(jiàn)照射區(qū)外表蒼白，一只出現(xiàn)心包積液，一只照射區(qū)局部心包粘連，橫斷切開(kāi)心肌，可見(jiàn)照射野處質(zhì)硬，呈灰白瘢痕狀，病理觀察照射區(qū)心肌可見(jiàn)退變及局灶性壞死，血管腫脹，周圍向外滲透，與未照射區(qū)有明顯差異。病理HE染色與未照射區(qū)相比，照射區(qū)心肌可見(jiàn)退變及局灶性壞死，血管腫脹，內(nèi)壁不規(guī)整，周圍向外滲透，有纖維形成。

3 討 論

放射治療是腫瘤治療的主要手段，食管下端、縱隔、左側(cè)乳腺等胸部腫瘤放療過(guò)程中即使采用調(diào)強(qiáng)放射治療、圖像引導(dǎo)放療等先進(jìn)技術(shù)也不可避免會(huì)使心臟受一定程度照射。RIHD是一種遠(yuǎn)期副反應(yīng)，癥狀主要表現(xiàn)在心包及心肌纖維化、加速冠狀動(dòng)脈粥樣硬化形成、心臟傳導(dǎo)阻滯及心瓣膜損傷［3］。已往多為放療后患者隨訪研究，受個(gè)體差異、治療方式、隨訪時(shí)間等多因素影響，而在實(shí)際臨床工作中，很難將RIHD表現(xiàn)出來(lái)的臨床癥狀與其他心臟疾病鑒別，目前尚沒(méi)有對(duì)RIHD無(wú)創(chuàng)性早期檢測(cè)的報(bào)告，有文獻(xiàn)報(bào)道胸部放療數(shù)月后照射野內(nèi)心臟FDG攝取率增高，提示可能與心肌損傷相關(guān)［4］。但這些研究中患者腫瘤位置各異，心臟受照部位及劑量／體積不同，且部分患者接受了化療以及伴有高血壓、高血脂、吸煙等常規(guī)心臟疾病高風(fēng)險(xiǎn)因素影響，增加了分析研究難度。筆者在臨床工作中也發(fā)現(xiàn)部分胸部腫瘤放療后患者18F-FDG復(fù)查時(shí)心臟FDG分布不均，本實(shí)驗(yàn)便是嘗試分析單因素心臟局部照射后病理改變與18F-FDG糖代謝變化情況，構(gòu)建RIHD模型及無(wú)創(chuàng)評(píng)估方法，可為進(jìn)一步研究RIHD提供良好的研究平臺(tái)。

一直以來(lái)，用來(lái)研究RIHD的主要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為嚙齒類動(dòng)物［5，6］，雖然易于獲得，生命力頑強(qiáng)，費(fèi)用少，但心臟體積太小，照射時(shí)很難將其分為照射區(qū)和非照射區(qū)，這樣不利于對(duì)照研究；也有報(bào)道使用兔子作為研究對(duì)象［7］，由于兔子對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較苛刻，死亡率高，易造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)缺失；本研究以實(shí)驗(yàn)比格犬作為研究對(duì)象，由于其心臟與人解剖結(jié)構(gòu)相似，不容易死亡，可以應(yīng)用臨床大型的醫(yī)學(xué)儀器直接檢測(cè)，更好地模擬人類的RIHD。RIHD動(dòng)物模型制備放射劑量應(yīng)大于20Gy，實(shí)驗(yàn)鼠研究表明，劑量取10Gy照射心臟損傷進(jìn)展緩慢，雖有病理心肌損傷改變，但生存期內(nèi)不出現(xiàn)心力衰竭癥狀；心臟受照劑量＞15Gy會(huì)引起有癥狀的心臟損傷，生存期內(nèi)會(huì)出現(xiàn)充血性心衰；單次劑量20Gy照射可引起不可逆的心臟損傷，減少動(dòng)物生存期。常用照射劑量為單次5 Gy～25 Gy照射或分次照射如9Gy／次×5次等，以單次照射常見(jiàn)，因?yàn)閱未握丈淇梢栽谳^短時(shí)間內(nèi)誘發(fā)與分次累積劑量照射等效的放射性損傷，有利于實(shí)驗(yàn)操作減少多次擺位誤差并縮短實(shí)驗(yàn)前期的等待時(shí)間等優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)照射采用CT模擬定位，圖像引導(dǎo)放療進(jìn)一步保證了照射靶區(qū)的精確性，構(gòu)建心臟局部放射損傷模型。

Lauk等［8］研究表明，放射導(dǎo)致微血管損傷主要源于放射線直接照射心肌內(nèi)直徑小于0.2 mm微血管的內(nèi)皮細(xì)胞，引起毛細(xì)血管損傷，最終導(dǎo)致心臟和心肌纖維化。Fajardo等［9］研究表明輻射加速了粥樣硬化斑塊的形成，且隨著照射劑量的增加，斑塊內(nèi)出血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的幾率增加，因此，更容易引起斑塊破裂，血栓形成。本實(shí)驗(yàn)雖無(wú)動(dòng)態(tài)觀測(cè)病理，但3個(gè)月HE染色結(jié)果顯示照射野小血管腫脹，內(nèi)壁不規(guī)整有斑塊形成，血管周圍外滲有纖維形成，基本與同類報(bào)道類似。18F-FDG是一種葡萄糖的類似物，為目前應(yīng)用最廣泛的正電子顯像劑，具有靈敏度、特異性好，臨床檢出率高以及可單次全身顯像等優(yōu)點(diǎn)，多用于腫瘤患者早期檢出、規(guī)范分期、放化療預(yù)后評(píng)價(jià)等，同時(shí)也被廣泛應(yīng)用存活心肌顯像［10］。糖負(fù)荷下行照射后心肌18F-FDG顯像，由于心肌照射區(qū)局部毛細(xì)血管損傷，影響心肌血供，限制脂肪酸代謝，無(wú)氧糖酵解增加，放射區(qū)域心肌攝取18F-FDG增加。所以對(duì)18F-FDG的攝取程度一定程度上可反映了該處心肌的損傷水平，可能作為RIHD無(wú)創(chuàng)性早期檢測(cè)的手段。本研究便是基于該理論假設(shè)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示照射后3個(gè)月實(shí)驗(yàn)犬前壁照射區(qū)心肌代謝增高，可發(fā)現(xiàn)與照射野一致的代謝增高區(qū)，驗(yàn)證了心肌18F-FDG顯像可早期檢測(cè)心肌輻射損傷。

綜上所述，采用20Gy對(duì)實(shí)驗(yàn)犬心臟前壁照射可以成功構(gòu)建局部RIHD模型，18F-FDG心肌代謝顯像可作為無(wú)創(chuàng)性評(píng)價(jià)RIHD模型是否構(gòu)建成功的檢測(cè)手段，這將為進(jìn)一步深入研究RIHD提供良好的研究平臺(tái)。

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