貫葉連翹提取物對(duì)擴(kuò)張型心肌病大鼠縫隙連接蛋白Cx43的影響*

尚 好，錢(qián)雅珍，陶厚權(quán)，李 樂(lè)△

（1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州310032；2.杭州市拱墅區(qū)小河湖墅地段社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心藥劑科，浙江杭州310011；3.浙江省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，杭州310032）

細(xì)胞縫隙連接是心肌細(xì)胞間唯一具有電連接作用的細(xì)胞間連接形式，通過(guò)縫隙連接蛋白43（connexin 43，Cx43）等進(jìn)行信息和能量物質(zhì)的交換，并對(duì)細(xì)胞新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、增殖和分化等生理過(guò)程起重要的調(diào)控作用。

貫葉連翹提取物（hypericum perforatum extract，HPE）為藤黃科植物貫葉連翹的帶花全草提取物（主要成分有金絲桃素、金絲桃苷等），用作中樞神經(jīng)抑制劑和抗憂(yōu)郁劑。擴(kuò)張型心肌?。╠ilated cardiomyopathy，DCM）是一種嚴(yán)重危害人們健康的心肌類(lèi)疾病，以膠原組織增多和間質(zhì)纖維化為主要病理特征并常伴有電生理紊亂［1］，在臨床上主要為心腔擴(kuò)大、心律失常以及心力衰竭。目前DCM的發(fā)病機(jī)制還不清楚。研究證明，心肌炎與DCM的發(fā)病存在密切的關(guān)系，通常認(rèn)為心肌炎是DCM的主要前驅(qū)表現(xiàn)［2］。我們課題組在前期研究中證實(shí)HPE有較好的抗免疫性心肌炎作用基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)采用阿霉素腹腔注射誘導(dǎo)Wistar大鼠DCM模型，探討HPE對(duì)DCM心肌縫隙連接蛋白Cx43的作用。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

注射用鹽酸多柔比星（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20120101）；貫葉連翹提取物（福州日冕科技開(kāi)發(fā)有限公司），生理鹽水配成5%濃度的溶液；Trizol試劑 （Ambion公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix PCR試劑盒（TaKaRa公司）；兔抗Cx 43抗體（Cell Signaling Technology公司）；PCR引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 動(dòng)物模型制備及治療給藥

健康Wistar雄性大鼠56只，體重200～215 g，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，合格證號(hào)2008001617932。將大鼠隨機(jī)分成正常組（n＝10），模型組（n＝46），模型組大鼠每周腹腔注射鹽酸多柔比星（阿霉素）3.0 mg／kg，連續(xù) 6周，停藥觀察2周，正常對(duì)照組對(duì)應(yīng)給予等量生理鹽水。第9周將模型組存活的大鼠根據(jù)眼眶血漿腦鈉肽激素（BNP）水平、體征、腹水等指標(biāo)，將存活的大鼠分為DCM組和治療組，治療組HPE灌胃給藥劑量100 mg／kg，每天2次，連續(xù)30 d，正常對(duì)照組及DCM組對(duì)應(yīng)給予等量生理鹽水。

1.3 切片染色檢測(cè)

治療結(jié)束后，無(wú)痛處死大鼠，取心臟心尖左心室部分于10%的福爾馬林的固定液中，根據(jù)HE、Masson染色步驟，分別將大鼠心肌切片染色，觀察。

1.4 Envision二步法免疫組化檢測(cè)Cx43蛋白表達(dá)

切片脫蠟至水、孵育、加一抗、蘇木精染色、切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明、中性樹(shù)膠封存，晾干后觀察。在×400光鏡下，每組6只動(dòng)物，每只動(dòng)物做6張切片，每張切片選取5個(gè)視野，利用 Image Pro Plus（IPP）6.0版本軟件，根據(jù)染料顏色深淺的值和陽(yáng)性表達(dá)面積來(lái)確定Cx43蛋白的量，測(cè)量圖片陽(yáng)性表達(dá)面積（area）和平均光密度（OD值）。

1.5 RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)Cx43 mRNA

采用Trizol一步法提取大鼠心室的總RNA，超微量分光光度計(jì)檢測(cè)OD260／OD280值，根據(jù)引物設(shè)計(jì)的原則，設(shè)計(jì)合成Cx43和內(nèi)參照β-actin的引物，Cx43引物：F：5’-GAAGCACCATCTCCAACTCGC-3’， R：5’-CGTTGGTCCACGATGGCTAAT-3’，長(zhǎng)度為 115 bp；β-actin引物：F：5’-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，R：5’-CATTGCCGATAGTGATGACCT-3’，長(zhǎng)度為143 bp。擴(kuò)增條件：（1）預(yù)變性：95℃，4 min；（2）變性：95℃，10 s；（3）退火延伸：56℃，20 s，共 40個(gè)循環(huán)，進(jìn)行 RT-PCR反應(yīng)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用 SPSS 19.0專(zhuān)業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。各組間采用單因素方差分析，兩組間用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 大鼠存活情況

整個(gè)造模過(guò)程中，正常對(duì)照組全部存活，造模期間DCM模型組大鼠第三周開(kāi)始普遍出現(xiàn)活動(dòng)減少，厭食，體重下降明顯，血性胸腹水，部分出現(xiàn)前肢出血，且有腹水的大鼠在兩周內(nèi)死亡，總體死亡率為34.8%，尸檢觀察大鼠死亡可能與心力衰竭有關(guān)。HPE治療一月后，上述癥狀緩解，死亡率明顯降低（23.1%／47.1%，P＜0.01）。

2.2 大鼠病理切片觀察

Masson染色顯示膠原纖維呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)、肌纖維和紅細(xì)胞呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)褐色，DCM組心肌纖維排列紊亂，間質(zhì)膠原沉積布滿(mǎn)心肌間隙，間質(zhì)膠原沉積明顯多于正常組和治療組，顯示DCM大鼠嚴(yán)重心肌纖維化（圖1）。

Fig.1 Expression of collagen in the myocardium of rat（Masson×100）

2.3 免疫組化半定量Cx43蛋白表達(dá)量

Envision法免疫組化顯示棕黃色為Cx43蛋白表達(dá)染色，紫色為細(xì)胞核，正常組陽(yáng)性著色點(diǎn)分布規(guī)律且廣泛，大多數(shù)分布在心肌纖維長(zhǎng)軸垂直的端-端連接處，DCM組僅可見(jiàn)大量藍(lán)色的細(xì)胞核，僅有少量的棕黃色陽(yáng)性部分表達(dá)且存在側(cè)-側(cè)連接，治療組著色顆粒明顯，分布較DCM更有序（圖2）。

Fig.2 Expression of Cx43 in left ventricular of rat（Envision×400）

正常組可見(jiàn)大量的Cx43陽(yáng)性表達(dá)；DCM組的Cx43表達(dá)較正常組明顯減少（P＜0.01），而且分布稀疏，顏色淺淡；HPE治療組的Cx43表達(dá)較 DCM組明顯增多（P＜0.05），顏色深染，而且分布均勻有規(guī)律（表1）。

2.4 Cx43 RT-PCR結(jié)果

應(yīng)用Mx 3000PReal Time PCR擴(kuò)增儀完成擴(kuò)增后，根據(jù)2-△△△Ct法原理計(jì)算相對(duì)定量，Cx43目的基因的相對(duì)表達(dá)量＝2-（Cx43Ct-β-actinCt），表 2為各組大鼠心肌 Cx43 mRNA表達(dá)量的變化，圖3為各組樣本擴(kuò)增曲線(xiàn)。

Tab.1 Indicators of myocardial tissue Cx43 protein expression（ˉx±s，n＝7）

Fig.3 Amplification curve of Cx43 mRNA

與正常組相比，DCM組Cx43 mRNA的表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。與DCM組相比，治療組大鼠Cx43 mRNA的表達(dá)升高明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表2）。

Tab.2 Changes in myocardial tissue expression of Cx43 mRNA（ˉx±s，n＝7）

3 討論

Cx43是心室縫隙連接最重要的蛋白，主要分布于閏盤(pán)，參與和影響心臟電生理活動(dòng)，包括電激動(dòng)的傳導(dǎo)速度、心肌電偶聯(lián)等，若Cx43數(shù)量及結(jié)構(gòu)變化可引起通道電阻增加，縱向傳導(dǎo)受阻，傳導(dǎo)速度嚴(yán)重下降，傳導(dǎo)的各向異性發(fā)生顯著變化。這些改變將導(dǎo)致傳導(dǎo)阻滯和折返傳導(dǎo)，誘發(fā)心律失常［3］。擴(kuò)張型心肌病大鼠心衰時(shí)，Cx43在心肌細(xì)胞上的表達(dá)減少、個(gè)體減小和分布異常引起的心室縫隙連接蛋白Cx43重構(gòu)，導(dǎo)致電位失偶聯(lián)增加，心室肌細(xì)胞除復(fù)極時(shí)間延長(zhǎng)，易誘發(fā)心律失常。

病理過(guò)程中AngⅡ升高激活PKC活性，誘使Cx43磷酸化，加快Cx43的降解，使得心律失常易感性增加。而PKA的激活則在通過(guò)誘導(dǎo)Cx43磷酸化的情況下，使得Cx43的表達(dá)增加［4］，但具體機(jī)制尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn) DCM組大鼠Cx43蛋白以及Cx43 mRNA表達(dá)顯著減少，雖然擴(kuò)張型心肌病過(guò)程中AngⅡ升高過(guò)程促發(fā)Cx43表達(dá)增加，但擴(kuò)張型心肌病過(guò)程長(zhǎng)期交感神經(jīng)興奮使得包括去甲腎上腺素（NA）在內(nèi)的兒茶酚胺積聚，在心衰早期，去甲腎上腺素濃度升高刺激β受體活化，但隨著NA濃度的進(jìn)一步上升，β受體密度下調(diào)且配體-受體開(kāi)始解偶聯(lián)，β受體系統(tǒng)脫敏使得 Cx43表達(dá)減少［5］。

DCM引起心臟的前后負(fù)荷增加，機(jī)體在應(yīng)激條件下作相應(yīng)的代償反應(yīng)，若得不到及時(shí)的治療，易引起心肌能量產(chǎn)生與利用障礙，進(jìn)一步的心肌纖維化引發(fā)心室重構(gòu)，而Cx43的表達(dá)減少及分布異常可看作分子水平的心臟重構(gòu)，最終因不可逆性的心力衰竭死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HPE治療后，明顯降低DCM大鼠死亡率，大鼠心肌組織Cx43蛋白及Cx43 mRNA表達(dá)顯著升高，可能有助于緩解DCM大鼠心力衰竭，HPE是如何影響Cx43表達(dá)的機(jī)制需進(jìn)一步研究。

［1］ van der Zwaag PA，van Rijsingen IA，Asimaki A，et al.Phospholamban R14del mutation in patients diagnosed with dilated cardiomyopathy or arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy：evidence supporting the concept of arrhythmogenic cardiomyopathy［J］.Eur J Heart Fail，2012，14（11）：1199-1207.

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