神經(jīng)肽CRH對原代大鼠皮層小膠質(zhì)細胞NO、TNF-α和IL-6釋放的影響*

畢燕華，宋婷婷，陳學(xué)群，杜繼曾

（浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系神經(jīng)生物學(xué)和生理學(xué)研究室，杭州310058）

促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin-releasing hor-mone，CRH）及其受體CRHRs是HPA（hypothalamus-pituitaryadrenal，HPA）軸主要的調(diào)節(jié)因子，CRH通過其G蛋白偶聯(lián)受體參與體內(nèi)各種生理功能，其受體分 CRHR1和 CRHR2，CRHR兩種受體在大腦及外周神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布。很多研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)激產(chǎn)生的CRH參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，如在阿爾茨海默病中和帕金森疾病中發(fā)現(xiàn)CRH的含量急劇下降、CRHR上調(diào)以及CRH神經(jīng)元異常等。同時CRH在外周免疫系統(tǒng)中扮演著一個促炎癥的角色，加劇LPS導(dǎo)致的巨噬細胞炎癥因子TNF-α和IL-6的mRNA表達，激活粒細胞中的NF-κB活性，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)參與免疫炎癥反應(yīng)。

小膠質(zhì)細胞被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為重要的免疫細胞，時刻監(jiān)督著腦內(nèi)微環(huán)境，在生理狀態(tài)下小膠質(zhì)細胞呈靜息的分枝狀態(tài)，監(jiān)督損傷的神經(jīng)元、感染或斑塊等，當(dāng)小膠質(zhì)細胞激活后呈現(xiàn)阿米巴樣狀態(tài)，產(chǎn)生神經(jīng)毒性物質(zhì)，釋放促炎癥因子如TNF-α、IL-1β和IL-6等，導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷和凋亡。Jiyeon Ock等發(fā)現(xiàn)0～100 nmol／L CRH不影響LPS誘導(dǎo)的BV2細胞NO和IL-1β的產(chǎn)生，而Wei Wang等實驗顯示10～100 nmol／L CRH可以明顯促進原代大鼠小膠質(zhì)細胞釋放TNF-α。但CRH是否直接參與調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的激活，至今不清楚，本研究試圖探討神經(jīng)肽CRH是否調(diào)節(jié)原代大鼠皮層小膠質(zhì)細胞的激活反應(yīng)，增加促炎癥反應(yīng)，其受體機制如何？是否可以協(xié)同LPS進一步增加炎癥反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

取新生1～2 d的SD大鼠8只，經(jīng)75%乙醇消毒后，用手術(shù)剪將其頭剪下，置于鋪有預(yù)冷解剖液HBSS（1%penicillin streptomycin）的35 mm培養(yǎng)皿中。打開顱骨，取出大腦，用解剖鑷除去腦膜其他非皮層組織后，將剩余皮層組織迅速移入預(yù)冷的HBSS中。在解剖顯微鏡下，用解剖刀除去中腦，分離皮層，去除海馬，將分離出的皮層放入2 ml 0.25%胰酶37℃消化12 min，消化后的細胞加入細胞培養(yǎng)基（MEM＋10%FBS），離心重懸至T-75 cm2培養(yǎng)皿，培養(yǎng)10 d，待細胞培養(yǎng)瓶中細胞長至10 d約98%融合后，輕輕搖晃至小膠質(zhì)細胞脫落，得到懸浮于培養(yǎng)液的小膠質(zhì)細胞，2 800 r／min，離心 5 min，加入新鮮的培養(yǎng)基（DMEM＋0.1%FBS）混勻，接種于24孔板，放入37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng) 16～24 h后，細胞呈現(xiàn)單級或雙極靜息分枝狀態(tài)，胞體無明顯空泡，且CD11b鑒定為純度大于98%以上用于實驗研究。

1.2 CRH處理

純化后的小膠質(zhì)細胞貼壁培養(yǎng)16～24 h之后，隨機將細胞樣品分為 5組（n＝6）：空白對照組；10-15mol／L CRH處理組；10-12mol／L CRH處理組；10-10mol／L CRH處理組和 10 ng／ml LPS處理組，處理24 h之后，收集細胞上清用于實驗檢測。

1.3 實驗方法

1.3.1 NO檢測 NO試劑盒來自碧云天生物技術(shù)研究所。取細胞培養(yǎng)液上清進行NO檢測，取出格里斯試劑I和II，用前恢復(fù)至室溫。用細胞培養(yǎng)液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，使之濃度分別達到 0，1，2，3，4，5，6，8，10，20，40，60，100μmol／L。按照每孔 50 μl，在96孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品及樣品，其次按照每孔50μl，在各孔中加入格里斯試劑I，再次按照每孔50μl，在各孔中加入格里斯試劑II。避光反應(yīng)5 min。570 nm測定吸光度。

1.3.2 ELISA檢測TNF-α和IL-6 將所需酶標(biāo)板、稀釋好的ABC和 TMB顯色液在 37℃平衡 30 min。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，將4 000 pg／ml，2 000 pg／ml，1 000 pg／ml，500 pg／ml，250 pg／ml，125 pg／ml，62.5 pg／ml，31.25 pg／ml依次加入孔中，另 1孔只加樣品稀釋液的作為零孔。加細胞上清100μl，10 ng／ml LPS處理過的細胞（陽性對照）上清稀釋10倍之后加入100μl。酶標(biāo)板上加蓋，37℃反應(yīng)90 min。棄酶標(biāo)孔中的液體，不洗。將準(zhǔn)備好的生物素抗大鼠TNF-α或IL-6抗體工作液按每孔0.1 ml依次加入。37℃反應(yīng) 60 min。0.01 mol／L PBS洗滌 3次，每次浸泡1 min左右。將準(zhǔn)備好的ABC工作液按每孔0.1 ml依次加入。37℃反應(yīng)30 min。0.01 mol／L PBS洗滌5次，每次浸泡1～2 min。按每孔90μl依次加入已在37℃平衡30 min的TMB平衡液，37℃避光反應(yīng)20～25 min。按每孔0.1 ml依次加入TMB終止液。用酶標(biāo)儀在450 nm測定吸光值后換算為相應(yīng)濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)誤（ˉx±sˉx）表示，用 SPSS 15.0軟件分析，兩組間比較采用 t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)肽CRH刺激原代大鼠皮層小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生NO，TNF-α和 IL-6

不同濃度的 CRH（10-15、10-12和 10-10mol／L）孵育小膠質(zhì)細胞24 h后，與空白對照組比較，發(fā)現(xiàn)10-15mol／L CRH可以促進小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生 NO、TNF-α和 IL-6（P＜0.01，圖 1 A、B和C）。不同濃度的 CRH（10-15、10-12和 10-10mol／L）孵育小膠質(zhì)細胞30 min后，加入10 ng／ml LPS孵育24 h后，與單獨 LPS組比較，10-15mol／L CRH可以促進小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生NO，TNF-α和IL-6（P＜0.05，圖 1 D、E和 F）。

Fig.1 Effect of CRH on proinflammatory molecule NO，TNF-α and IL-6 production in microglia（ˉx±sˉx，n＝6）Microglia were treated by 10-15 mol／L CRH for 24 hours（A，B and C）.Microglia were pretreated 10-15 mol／L CRH for 30 min followed by treatment with 10 ng／ml LPSfor 24 hours（D，E and F）

2.2 CRHR1拮抗劑可以阻斷CRH誘導(dǎo)的原代大鼠皮層小膠質(zhì)細胞NO的產(chǎn)生

CRHR1拮抗劑10-12mol／L CP154，526處理原代皮層小膠質(zhì)細胞30 min后加入10-15mol／L CRH孵育 24 h，發(fā)現(xiàn) 10-12mol／L CP154，526能完全阻斷 10-15mol／L CRH誘導(dǎo)皮層小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的 NO（P＜0.01 vs 10-15mol／L CRH組，圖 2A）。此外10-12mol／L CRHR1拮抗劑CP154，526處理原代皮層小膠質(zhì)細胞30 min后，加入10-15mol／L CRH孵育30 min，再加入10 ng／ml LPS孵育 24 h，發(fā)現(xiàn) 10-12mol／L CP154，526能完全阻斷10-15mol／L CRH＋LPS誘導(dǎo)皮層小膠質(zhì)細胞NO的產(chǎn)生（P＜0.01 vs 10-15mol／L CRH ＋LPS組，圖 2B）。

Fig.2 Inhibitory effect of CRHR1 specific antagonist CP154，526 on microglia NOproduction（ˉx±sˉx，n＝6）

3 討論

小膠質(zhì)細胞被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細胞，參與腦內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的保護或損傷，突觸剪切和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等。靜息的小膠質(zhì)細胞在腦內(nèi)起到免疫監(jiān)督作用，時刻監(jiān)督腦內(nèi)微環(huán)境的變化，當(dāng)小膠質(zhì)細胞激活后，吞噬功能增強，促炎癥因子和活性氧物質(zhì)釋放增多，導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡甚至死亡。腦損傷、低氧、缺血以及神經(jīng)退行性疾?。ˋD和PD），常伴隨著腦內(nèi)炎癥的出現(xiàn)，誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞激活，小膠質(zhì)細胞的激活經(jīng)常被認(rèn)為是神經(jīng)元凋亡的前期標(biāo)志［1］。NO是由激活的小膠質(zhì)細胞iNOS產(chǎn)生，同時參與調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的吞噬功能變化，可致細胞毒性，損傷神經(jīng)元［2］。本研究證明CRH能促進小膠質(zhì)細胞釋放促炎癥介質(zhì)NO、TNF-α和IL-6，并且在1 f mol／L濃度下明顯刺激小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生NO，提示CRH在低濃度時即可參與小膠質(zhì)細胞釋放促炎癥介質(zhì)NO，可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常的基礎(chǔ)。

CRH參與了眾多生理學(xué)應(yīng)激反應(yīng)，加重中風(fēng)之后的損傷，CRH在外周參與免疫炎癥反應(yīng)［3-4］，另外在LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克小鼠模型中，Agelaki S et al發(fā)現(xiàn)CRH增強巨噬細胞產(chǎn)生促炎癥因子IL-1、TNF-α和IL-6的釋放。Jiyeon Ock等發(fā)現(xiàn)CRH誘導(dǎo)小鼠前腦原代小膠質(zhì)細胞和BV2細胞（小膠質(zhì)細胞的小鼠細胞系）凋亡來調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，但沒有證實CRH是否直接參與小膠質(zhì)細胞激活。早期Wei Wang等發(fā)表的結(jié)果認(rèn)為CRH通過MAPK途徑誘導(dǎo)原代大鼠小膠質(zhì)細胞增殖和分泌TNF-α，以后Yang等報道CRH調(diào)節(jié)小鼠小膠質(zhì)細胞分泌IL-18。Mei-Jen Wang等研究顯示Urocortin調(diào)節(jié)大鼠和BV2小膠質(zhì)細胞激活導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷是通過PI3／Akt通路和GSK-3β通路，而并非是經(jīng)典的cAMP通路［5］。我們的結(jié)果顯示CRH和 LPS可以協(xié)同刺激小膠質(zhì)細胞激活，并產(chǎn)生TNF-α和IL-6，提示CRHR受體的信號通路和LPS的信號通路可能有交叉對話，P38／MAPK是CRH和LPS共同通路的交叉部分，CRH增強LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞激活過程中，CRH＋LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的促炎癥介質(zhì)NO、TNF-α和IL-6比單獨LPS明顯升高，并且CRH和LPS協(xié)同誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞釋放促炎癥介質(zhì)，也可被CRHR1特異性拮抗劑CP154，526完全阻斷。

本實驗提示CRH不僅通過CRHR1參與調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的激活，還同時調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞激活。CRH作為應(yīng)激反應(yīng)中的重要調(diào)控因子，可能通過小膠質(zhì)細胞調(diào)節(jié)CNS的免疫反應(yīng)，當(dāng)腦內(nèi)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時，CRH通過CRHR1和TRL4交叉對話，進一步加劇免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)。提示應(yīng)激誘導(dǎo)的CRH變化可能通過CRHR1和TRL4分子交叉對話加劇神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)和臨床癥狀，信號通路的交叉對話點可能成為小膠質(zhì)細胞功能相關(guān)分子機制研究的基礎(chǔ)和未來臨床干預(yù)的靶點。為改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)退行性疾病進程提供新的研究思路和干預(yù)目標(biāo)。

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