熊果酸對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠心肌纖維化作用的研究*

楊鈞杰，宮 燕，史 杰，齊敏友

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州310014）

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病常見而危害嚴(yán)重的并發(fā)癥。其發(fā)病機(jī)制主要與氧化應(yīng)激、心肌纖維化、炎癥因子、腎素－血管緊張素（renin-angiotensin system，RAS）系統(tǒng)激活有關(guān)［1，2］。近年來轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）在心肌纖維的進(jìn)程中受到關(guān)注［3］。熊果酸（ursolic acid，UA）是一種存在于天然植物中的α－香樹脂醇（α－amyrin）型五環(huán)三萜類化合物，是許多中藥復(fù)方的主要有效成分之一?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，UA具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化、抗肝纖維化等作用［4，5］，但其是否可以通過抑制心肌 TGF-β1的表達(dá)抗糖尿病心肌纖維化尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過四氧嘧啶建立糖尿病小鼠心肌病變模型，觀察熊果酸對(duì)糖尿病小鼠心肌病的作用，初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性昆明種小鼠，體重（20±2）g，由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào)：SCXK（浙）-2008-0033。

1.1.2 藥物和主要試劑 熊果酸（HPLC測定純度98.25%），由湖南上禾生物科技提供；貝那普利（Benazepril），由北京諾華提供；四氧嘧啶，由sigma公司生產(chǎn)，上海貝基生物有限公司分裝，批號(hào)：10080210；MDA、SOD試劑盒，考馬斯亮蘭測試盒，均由南京建成生物工程有限公司提供；兔抗大鼠TGF-β1抗體，由武漢博士德公司提供。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 血糖測定儀（美國強(qiáng)生公司）；離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)（鞏義市英峪予華儀器廠）；104型電子天平（Made by Mettler-Toledo Group）；石蠟切片機(jī)（日本日立公司）；WB22型恒溫水浴箱（Made in German）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病小鼠模型的建立 雄性昆明種小鼠分籠飼養(yǎng)，禁食不禁水12 h后，一次性尾靜脈注射四氧嘧啶（70 mg／kg）。正常喂食15 d后，空腹12 h尾靜脈取血測定血糖，將血糖高于13.9 mmol／L的小鼠按隨機(jī)分為模型組、熊果酸組和貝那普利組（n＝10），另取10只健康小鼠作為正常對(duì)照組。熊果酸以生理鹽水混懸后灌胃（35 mg／kg，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定此劑量），貝那普利組（5 mg／kg，p.o.），正常組和模型組用等體積生理鹽水灌胃，持續(xù)8周。

1.2.2 血糖測定 末次給藥后空腹12 h，尾靜脈取血，用血糖測定儀測定各組小鼠血糖。

1.2.3 臟器系數(shù) 處死小鼠后，快速取出心臟，去除心包膜、血管，生理鹽水洗凈，濾紙吸干后稱取全心重。剪去右心室及心房部分，吸干稱取左心室重，根據(jù)末次體重計(jì)算心臟臟器系數(shù)（左心室重／全心重、全心重／體重）。

1.2.4 生化指標(biāo)測定 取適量左心室心肌組織，用0.9%冷生理鹽水制成10%均漿液，離心（3 000 r／min，10 min），取上清液，-20℃保存。按照試劑盒說明書檢測心肌組織SOD活性，MDA和羥脯氨酸的含量。

1.2.5 組織學(xué)檢測 取心肌組織以10%中性甲醛固定，石蠟包埋切片，進(jìn)行Masson染色，膠原成纖維細(xì)胞呈藍(lán)色，于光鏡下觀察。

1.2.6 免疫組化檢測 取各組小鼠心肌組織石蠟包埋制成4μm切片。切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2處理，抗原熱修復(fù)。以正常山羊血清封閉后，滴加兔抗大鼠TGF-β1抗體，4℃孵育過夜。滴加Envision工作液室溫30 min。用DAB顯色，控制顯色程度后水洗。蘇木素襯染，二甲苯透明，樹膠封片。半定量分析：在400倍光鏡下隨機(jī)選取組織結(jié)構(gòu)保存較好的切片，取6個(gè)視野點(diǎn)，用Image-Pro Plus 5.0病理圖像分析軟件分析，測定陽性顆粒（TGF-β1陽性為棕黃色顆粒）的平均吸光度，計(jì)算均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)應(yīng)用SPSS 17.0軟件，采用單因素方差分析（ANOVA），并作組間兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 熊果酸對(duì)小鼠一般體征、血糖影響

正常組小鼠精神狀態(tài)良好、反應(yīng)靈敏、毛色有光澤，體重逐漸增加。造模小鼠表現(xiàn)為明顯的多飲、多食、多尿癥狀，同時(shí)體重減輕，且小鼠血糖明顯上升，熊果酸和貝那普利組對(duì)小鼠的一般體征有改善作用，熊果酸治療組血糖較模型組下降，表明熊果酸具有較好的降血糖作用（P＜0.01，表 1）。

Tab.1 Changes of the body weight and blood glucose level（ˉx±s，n＝10）

2.2 熊果酸對(duì)心臟臟器系數(shù)的影響

模型組小鼠全心和左心室臟器系數(shù)較正常組升高（P＜0.05），熊果酸和貝那普利組其值接近正常水平。結(jié)果顯示：熊果酸和貝那普利組對(duì)心臟器系數(shù)有明顯改善作用（P＜0.01，表 2）。

Tab.2 Index of heart weight of mice（ˉx±s，n＝10）

2.3 熊果酸對(duì)心肌組織SOD活力、MDA和HPY含量的影響

與對(duì)照組相比，模型組心肌組織中SOD活性明顯降低（P＜0.05），MDA含量明顯升高（P＜0.01），羥脯氨酸含量明顯升高（P＜0.01），表明心肌內(nèi)存在過度的氧自由基，機(jī)體抗氧化能力下降，膠原纖維增生明顯，熊果酸和貝那普利組對(duì)上述改變具有良好的改善作用（P＜0.01，表 3）。

2.4 熊果酸對(duì)心肌組織形態(tài)學(xué)的影響

心肌組織Masson染色，400倍光鏡下觀察。結(jié)果顯示：正常組小鼠心肌組織僅可見少量藍(lán)色斑點(diǎn)，表明心肌中膠原很少；模型組小鼠心肌內(nèi)層及間質(zhì)中可見多處藍(lán)色大面積的塊狀瘢痕組織，為膠原蛋白過度表達(dá)及心肌壞死后成纖維細(xì)胞增生所致；熊果酸組對(duì)上述改變有明顯的改善作用。箭頭所示為心肌膠原纖維（圖1）。

Tab.3 Content of SODand MDA in myocardium（ˉx±s，n＝10）

Fig.1 Expression of collagen protein in myocardium tissues of mice（Masson×400）

2.5 心肌組織中TGF-β1表達(dá)的變化

與正常組比較，模型組小鼠心肌細(xì)胞胞漿中有較多棕黃色顆粒狀物質(zhì)，呈強(qiáng)陽性反應(yīng)；熊果酸組棕黃色顆粒數(shù)明顯減少，半定量分析結(jié)果顯示：提示熊果酸和貝那普利均能抑制TGF-β1蛋白的表達(dá)（P＜0.05）。箭頭所示為 TGF-β1蛋白的表達(dá)（圖 2）。

Fig.2 Expression of TGF-β1 in myocardium tissues of mice（immunohistochemical staining×400）

3 討論

糖尿病心肌病是導(dǎo)致糖尿病患者心功能不全的臨床常見并發(fā)癥之一，其發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全明確。糖尿病導(dǎo)致的心肌細(xì)胞代謝紊亂、胰島素抵抗，心肌局部RAS系統(tǒng)過度激活，氧化應(yīng)激等均能引起心肌結(jié)構(gòu)和功能改變，在糖尿病心肌組織形態(tài)學(xué)上主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞局灶性肥大、壞死，細(xì)胞外基質(zhì)沉積和心肌纖維化［5］。本實(shí)驗(yàn)采用四氧嘧啶一次性尾靜脈注射方法制備的小鼠糖尿病模型，血糖均13.9 mmol／L，且“三多一少”癥狀明顯，心肌組織中羥脯氨酸含量增高，Masson染色顯示心肌細(xì)胞肥大，排列紊亂，心肌間質(zhì)膠原纖維沉積和纖維化，說明模型建立成功。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果上看，熊果酸具有降低血糖，改善糖尿病小鼠心肌組織纖維化的作用。

氧化應(yīng)激在糖尿病心肌病變中起著重要作用，可通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs），進(jìn)而可引起心肌纖維化［6，7］，而MDA含量和SOD活性是其兩個(gè)重要指標(biāo)。研究結(jié)果顯示：模型組心肌組織中脂質(zhì)過氧化物明顯增多，而清除活性氧的超氧化物歧化酶活力降低，表明四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的心肌氧化應(yīng)激狀態(tài)增強(qiáng)，加重心肌損傷并引起心肌結(jié)構(gòu)改變。陽性藥物貝那普利干預(yù)后，心肌組織中SOD活性升高；MDA、HYP含量下降。糖尿病時(shí)，RAS系統(tǒng)激活，心肌局部血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）水平升高，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，引起心肌內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。貝那普利作為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，能夠有效抑制甚至逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象，通過降低心肌局部AngⅡ水平，減輕心肌氧化應(yīng)激狀態(tài)。而熊果酸組，心肌組織中MDA含量明顯降低；同時(shí)SOD活性提高，顯示熊果酸具有較好的抗氧化能力，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［8］，其具體途徑是否與降低心肌AngⅡ水平有關(guān)有待進(jìn)一步研究。

諸多的生長因子表達(dá)增加在糖尿病狀態(tài)下組織器官纖維化形成中起重要作用，其中TGF-β1是一個(gè)關(guān)鍵的生長因子［9］，在糖尿病情況下，TGF-β1由其活化型的受體介導(dǎo)，在細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜上與蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)揮局部生物學(xué)效應(yīng)，促使成纖維細(xì)胞合成膠原纖維蛋白、蛋白多糖、纖維粘連蛋白，引起心肌纖維化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：熊果酸能夠顯著抑制糖尿病小鼠心肌組織中TGF-β1的表達(dá)，提示熊果酸可通過下調(diào)TGF-β1表達(dá)這一途徑，減少心肌纖維化。有文獻(xiàn)報(bào)道：貝那普利能抑制RAS系統(tǒng)激活，通過蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）途徑抑制 TGF-β1表達(dá)升高保護(hù)糖尿病腎?。?0］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：其亦能抑制心肌組織中的TGF-β1表達(dá)明顯下降，膠原表達(dá)減少，從而保護(hù)糖尿病心肌病變。

綜上所述，氧化應(yīng)激和TGF-β1過度表達(dá)參與糖尿病心肌病變的過程，熊果酸對(duì)糖尿病引起的心肌損傷具有良好的改善作用，其可能的作用機(jī)制包括降血糖、抗氧化和抑制TGF-β1表達(dá)等。由于目前對(duì)糖尿病心肌病變?nèi)狈τ行е委熓侄?，因此研究熊果酸治療DCM的作用和機(jī)制，對(duì)開發(fā)中藥治療糖尿病并發(fā)癥具有重要意義。

［1］ 宮 燕，陳 凱，喻蘇青，等.山茱萸總萜對(duì)糖尿病小鼠心肌病變的保護(hù)作用［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2012，28（4）：378-384.

［2］ Aydemir-Koksoy A，Bilginoglu A，Sariahmetoglu M，et al.Antioxidant treatment protects diabetic rats from cardiac dysfunction by preserving contractile protein targets of oxidative stress［J］.J Nutr Biochem，2010，21（9）：827-833.

［3］ Dobaczewski M，Chen W，F(xiàn)rangogiannis NG.Transforming growth factor（TGF）-βsignaling in cardiac remodeling［J］.J Mol Cell Cardiol，2011，51（4）：600-606.

［4］ Jang SM，Yee ST，Choi J，et al.Ursolic acid enhances the cellular immune system and pancreatic beta-cell function in streptozotocin-induced diabetic mice fed a high-fat diet［J］.Int Immunopharmacol，2009，9（1）：113-119.

［5］ Asbun J，Villarreal FJ.The pathogenesis of myocardial fibrosis in the setting of diabetic cardiomyopathy［J］.J Am Coll Cardiol，2006，47（4）：693-700.

［6］ Galli F，Battistoni A，Gambari R，et al.Oxidative stress and antioxidant therapy in cystic fibrosis［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1822（5）：690-713.

［7］ Sharma V，McNeill JH.Diabetic cardiomyopathy：Where are we 40 years later［J］？Can J Cardiol，2006，22（4）：305-308.

［8］ Wang ZH，Hsu CC，Huang CN，et al.Anti-glycative effects of oleanolic acid and ursolic acid in kidney of diabetic mice［J］.Eur J Pharmacol，2010，628（1-3）：255-260.

［9］ Roestenberg P，van Nieuwenhoven FA，Joles JA，et al.Temporal expression profile and distribution pattern indicate a role of connective tissue growth factor（CTGF／CCN-2）in diabetic nephropathy in mice［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2006，290（6）：F1344-F1354.

［10］陳爍蘋，鄭景晨，倪連松，等.血管緊張素-（1-7）對(duì)糖尿病大鼠腎臟PDGF、TGF-β的影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2008，24（4）：475-478.