二聯(lián)苯碘合并谷氨酰胺干預對過度訓練引起的中性粒細胞功能的調控及機制研究*

董靜梅，陳佩杰

（1.同濟大學體育教學部 上海200092；2.上海體育學院 上海200438）

過度訓練（overtraining，OT）引起的運動性免疫抑制與過氧化損傷是影響運動員身體健康，困擾運動員提高運動水平的難點問題，谷氨酰胺（glu-tamine，Gln）作為細胞能量代謝的底物，可有效提高運動員的運動能力［1］。但一個不容忽視的問題是：運動本身可引起的活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，而運動時Gln的補充在給予細胞能量的同時，又增加了體內組織細胞內源一氧化氮（nitric oxide，NO）的大量產(chǎn)生，這樣活性氧、活性氮的雙重因素可引起細胞的氧化損傷而導致細胞功能水平的下降［2］，前期的研究證明：運動時NADPH氧化酶是運動引起的細胞非特異免疫功能變化的調控靶點［3］?；诖耍狙芯渴状尾捎肗ADPH氧化酶抑制劑DPI與Gln補充作為合并干預的手段，分析探討過度訓練及其單純補充Gln與合并干預對機體氧化水平的影響及機制，以達到逆轉過度訓練引起的中性粒細胞過氧化損傷，為防護運動性免疫抑制的方法學提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

四甲基乙二胺（TEMED），二硫蘇糖醇（DTT），甘氨酸（G）購自美國Promega公司；蛋白Marker由中科院上海生物化學研究所監(jiān)制；苯磺酸（BSA）十二烷基硫酸鈉（SDS）三羥甲基氨基甲烷（Tris）均購自上海迪奧生物科技有限公司。谷氨酰胺（Gln）購自美國Sigma公司。一抗gp91phoxrabbit polyclonal IgG和P47phoxGoat polyclonal IgG及二抗rabbit polyclonal to Goat IgG-HRP、Goat polyclonal to Rabbit均購自美國Santa cruz公司；本實驗所有血液指標試劑盒均購自碧云天生物科技有限公司；呼吸爆發(fā)和吞噬功能檢測試劑盒購自德國Glycotope Biotechnology公司。

1.2 實驗動物及分組

50只雄性 Wistar大鼠（體重 225±6.7g），適應性喂養(yǎng)一周后（環(huán)境溫度20℃～25℃，每天光照時間保證12 h，自由飲食水）。隨機取8只作為安靜對照組（C），其余繼續(xù)進行4周的適應性跑臺訓練后，隨機分為4個組（n＝8）：單純過度訓練組（E）、過度訓練 DPI干預組（D）、過度訓練谷氨酰胺干預組（G）、過度訓練與DPI合并谷氨酰胺干預組（DG）。

1.3 訓練模型

整個訓練模型在參照巴西Hohl的方法［4］的基礎上，在最后一周的訓練時間延長至大鼠力竭，力竭的標準以大鼠四肢無力支持住身體、頭部低垂、電刺激后不能繼續(xù)正常奔跑為力竭標準，成功建模的標準以同安靜組比較，單純過度訓練組大鼠血漿皮質醇和睪酮在統(tǒng)計學意義上的顯著降低為據(jù)。

1.4 給藥時間及劑量

從第5周開始，D組在訓練前半小時腹腔注射DPI（Sigma，產(chǎn)品編號：D2926），給予濃度與方法參考［5］，G組參考金其貫的方法給予L-谷氨酰胺（Sigma，產(chǎn)品編號：G-3126）進行干預［6］，DG組按相同劑量與方法給予DPI與谷氨酰胺，同時E組給予與D、G組相同方法相同劑量的安慰劑（即DPI與Glu的稀釋液分別為5%葡萄糖注射液和0.9%生理鹽水（上海醫(yī)藥產(chǎn)））。

1.5 血樣收集

過度訓練指標的血樣采取：在第十一周大鼠訓練的最后兩天的次日早晨用毛細管取C組、E組大鼠眼眶靜脈叢血0.2 ml（EDTA抗凝），立即分離血漿用于皮質醇（cortisol，T）和睪酮（corticosterone，Cort）的檢測。

過度訓練后采血：為避免運動應激和麻醉劑對實驗結果的影響，這次采血所有大鼠均保證在末次訓練的36～40 h內眼眶靜脈叢取血3 ml血液分裝在EDTA抗凝管（0.5 ml，標記為A管）和肝素抗凝管（2.5 ml，標記為 B管）后立即斷頭處死。

1.6 中性粒細胞的分離與凍存

按多型核細胞分離液說明書取分離液1 ml與離心管中，將等比的1 ml血液小心鋪與分離液液面上后離心（450 g，35 min，18～22℃），分別用吸管吸取取中性粒細胞與淋巴細胞分離層后用0.45%NaCI低滲液洗兩次，用PBS洗一次后加入0.4%胎盼藍染色計數(shù)，調細胞濃度為1×107cells／ml，使制備好的活細胞數(shù)不低于96%后懸浮于預冷的適量RPMI-1640培養(yǎng)液后分取 500μl離心（2 500 r／min、5 min、4℃），棄上清，收集中性粒細胞凍存在-80℃以備測定蛋白濃度及Western blot實驗。

1.7 血漿指標的測定

中性粒細胞趨化因子（cytokine-induced neutrophil chemoattractant，CINC）、白介素-1β（interleukin，IL-1β）、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein，MCP-1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）、粒細胞集落刺激因子 （granulocyte colonystimulating factor，G-CSF）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、丙二醛（MDA）以及皮質醇，睪酮等指標的測定按酶聯(lián)免疫試劑盒（ELISA KIT）測定步驟進行。

1.8 NADPH氧化酶關鍵亞基gp91phox與 p47phox的蛋白印跡的測定

取出凍存的中性粒細胞，在凍融后分別加入PBS溶液1 ml，將樣品稀釋至已測定的總蛋白含量，取200μl樣品加入50μl 5×SDS上樣 buffer，95℃處理10 min后電泳。電泳約40 min后等到溴酚藍跑出分離膠即可停止電泳，用buffer平衡10 min后按規(guī)定的順序依次放好膠、膜及濾紙進行轉膜。轉膜后加入 anti-gp91phox、anti-p47phox（一抗）過夜，洗脫，再分別加入二抗搖床孵育1 h后，DAB顯色液顯色，TANON GIS-2008凝膠成像儀灰度掃描，GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析，測定目標條帶面積和灰度值，通過目標蛋白與內參對比進行半定量分析，目標蛋白含量＝條帶面積×平均灰度，蛋白半定量值＝目標蛋白含量／β-actin蛋白含量。

1.9 統(tǒng)計學分析

所有測試結果以平均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，用SPSS 11.5軟件分析處理，進行單因素方差分析的LSD對比分析；Pearson相關分析用于NADPH氧化酶活性與MPO、MDA的相關性分析；Stepwise法對中性粒細胞功能變化、NO生成與NADPH氧化酶活性之間的關系進行回歸分析。

2 結果

2.1 過度訓練后DPI合并Gln補充后血漿細胞因子的變化

同安靜對照組比較，過度訓練后E組血漿各細胞因子濃度均顯著性上升，其中 IL-1β、IL-6、CINC、GCSF達到非常顯著性水平；DPI干預組（D）除 IL-1β顯著下降（P＜0.01，表 1）。Gln補充組（G）中除 NO顯著上升外，其余細胞因子的變化基本同過度訓練組（E）。而DPI合并 Gln補充組（DG）中只有 NO和CINC顯著增加，其余各組的細胞因子濃度無顯著變化。過度訓練組、Gln補充組（G）中血漿 IL-1β、IL-6、TNF-α等這些炎性因子及G-CSF的表達增加，說明過度訓練可引起細胞炎性因子的分泌及中性粒細胞大量的募集而誘發(fā)炎癥的發(fā)生，DPI具有顯效的抑制這些炎癥因子的增加作用，同時Gln補充組（G）和DPI合并Gln補充組（DG）中血漿NO的水平均顯著增加，其中G組具有極其顯著性統(tǒng)計意義。

Tab.1 Concentration of cytokine in plasma after overtraining（ˉx±s，n＝8）

2.2 DPI合并Gln補充大鼠過度訓練后血漿過氧化水平的變化

通過實施DPI干預合并Gln補充，大鼠過度訓練后血漿MDA（圖1）同安靜對照組相比，過度訓練組（P＜0.01）及 Gln補充組（G）顯著上升（P＜0.05），DPI干預組（P＜0.05）及 DPI合并 Gln補充組（DG）（P＜0.01）則顯著低于過度訓練組。

2.3 DPI合并Gln補充大鼠過度訓練后血漿MPO及NADPH氧化酶活性的變化

圖2所示的大鼠過度訓練后各組血漿MPO的水平（圖2A）及NADPH氧化酶（圖2B）兩指標的變化基本相同，同安靜組比較，過度訓練組（E）與Gln補充組（G）的中性粒細胞活性均升高（P＜0.05），而DPI干預組及DPI合并Gln補充組（DG）顯著低于過度訓練組（P＜0.01），說明DPI能有效抑制中性粒細胞的激活和NADPH氧化酶，而DPI合并Gln補充組對中性粒細胞激活和NADPH氧化酶的抑制效果更為顯著。

Fig.1 Concentration of MDA in rat plasma after overtraining C：Control group；E：Overtraining group；D：Administration group；G：Glutamine supplementation group；DG：Combined DPI and glutamine group；MDA：Malondialdehyde

2.4 DPI干預合并Gln補充大鼠過度訓練后離體外周血中性粒呼吸爆發(fā)和吞噬功能的變化

過度訓練后各組中性粒細胞呼吸爆發(fā)的氧化細胞百分比與平均熒光強度的檢測結果顯示（圖3A）：同安靜對照組比較，大鼠中性粒細胞呼吸爆發(fā)的氧化細胞百分比與平均熒光強度同步在單純過度訓練組（E）顯著降低（P＜0.05），DPI干預組（D）與 Gln補充組（G）兩者也有降低但未達到顯著性水平。但各組同過度訓練組（E）相比，DPI干預組（D）、Gln補充組（G）及其 DPI合并Gln補充組（DG）的呼吸爆發(fā)氧化細胞百分比與平均熒光強度則有同步上調的趨勢，并且DPI合并Gln補充組（DG）中性粒細胞呼吸爆發(fā)的上調達到顯著性水平（P＜0.05）。

Fig.2 Concentration of MPO and the activity of NADPH-oxidase after overtraining

Fig.3 Changes of the neutrophils function after overtraining in five groups

而過度訓練后各組中性粒細胞吞噬功能檢測結果與呼吸爆發(fā)功能完全不同的是（圖3B）：同安靜對照組（C）相比，過度訓練組（E）的吞噬功能顯著降低達到非常顯著性水平，但DPI干預組（D）、Gln補充組（G）及其DPI合并Gln補充組（DG）的吞噬功能則無顯著變化，但與過度訓練（E）組比較，DPI干預組（D）、Gln補充組（G）及其 DPI合并 Gln補充組（DG）三組的吞噬功能則有程度不一的升高，其中DPI合并Gln補充組（DG）的升高達到非常顯著性水平（P＜0.01）。此結果說明過度訓練可引起中性粒細胞吞噬功能的顯著下降，而單純DPI和Gln有逆轉其功能下降的趨勢，但DPI和Gln的合并干預能更有效的逆轉。

2.5 過度訓練后DPI干預合并Gln補充大鼠中性粒細胞NADPH氧化酶關鍵亞基gp91phox和p47phox的蛋白表達

過度訓練后利用Western blot方法測定各組大鼠中性粒細胞中NADPH氧化酶關鍵亞基gp91phox和p47phox蛋白表達的結果顯示：同安靜組（C）比較，過度訓練組（E）中大鼠中性粒細胞 NADPH氧化酶gp91phox和 p47phox的表達均顯著上調（P＜0.01），而除了DPI合并Gln補充組（DG）的 gp91phox的蛋白表達顯著下調（P＜0.05）外，其余各組的 gp91phox和p47phox蛋白表達均無顯著性變化；但同過度訓練組（E）比較 DPI干預組（D）、Gln補充組（G）及 DPI合并Gln補充組（DG），無論是 gp91phox還是 p47phox的蛋白表達均顯著下調，甚至在DPI合并Gln補充組（DG）的gp91phox的蛋白表達下調達到了非常顯著性水平（圖4）。這說明過度訓練可引起中性粒細胞的NADPH氧化酶關鍵亞基gp91phox和 p47phox的蛋白表達上調，而單純的DPI干預和Gln的補充可抑制這種上調的趨勢，兩種合并干預可有效的抑制這種由于過度訓練引起的NADPH氧化酶關鍵亞基gp91phox蛋白表達的上調。

Fig.4 Expression of gp91phox and p47phox of NADPH-oxidase in neutrophils induced by overtraining

3 討論

3.1 過度訓練對中性粒細胞功能的影響

過度訓練作為一種刺激可誘發(fā)一系列的生理及免疫功能的綜合反應進而影響到運動員正常運動技能的發(fā)揮。本研究前期［7］對過度訓練后中性粒細胞的凋亡，淋巴細胞的DNA損傷以及中性粒細胞體外呼吸爆發(fā)與吞噬功能進行測定發(fā)現(xiàn)：過度訓練激活NADPH氧化酶而使中性粒細胞產(chǎn)生和氧化應激［7］。而本實驗的研究揭示：過度訓練可引起外周血漿炎性因子、趨化分子分泌增加，中性粒細胞募集及外滲相關的黏附蛋白的表達上調等可誘發(fā)周圍組織炎癥的發(fā)生；同時過度訓練后NADPH氧化酶關鍵亞基gp91phox和 p47phox的蛋白表達均顯著上調，根據(jù)這兩種蛋白移位至質膜上的共定位分子遷移理論［8］證明：過度訓練激活中性粒細胞NADPH氧化酶而引起呼吸爆發(fā)產(chǎn)生ROS。而這些炎性因子及ROS的產(chǎn)生又可反饋性的激活NADPHA氧化酶引發(fā)中性粒細胞的過度激活，產(chǎn)生過多的ROS，因而引起中性粒細胞的凋亡甚至壞死從而導致中性粒細胞呼吸爆發(fā)和吞噬功能的降低。

3.2 中性粒細胞的谷氨酰胺代謝及補充對中性粒細胞功能的影響

谷氨酰胺在細胞能量代謝中的作用早已被大家所認同，大量的體外孵育處理和在體實驗均提示谷氨酰胺在調節(jié)細胞的黏附和中性粒細胞遷移中具有重要作用。本實驗發(fā)現(xiàn)補充谷氨酰胺有提升中性粒呼吸爆發(fā)和吞噬功能改變的趨勢；而補充谷氨酰胺組NADPH氧化酶關鍵亞基gp91phox和 p47phox的蛋白表達未有變化可以斷定谷氨酰胺的補充對激活中性粒細胞NADPH氧化酶無顯著的作用，但可有效逆轉由于過度運動引起的中性粒細胞呼吸爆發(fā)與吞噬功能。

但較為矛盾的是過度訓練狀態(tài)下線粒體活性氧生成增多［9］，血液中 IL-6、G-CSF的濃度增加，血漿過氧化水平的增加、MPO及NADPH氧化酶活性的增加，而補充谷氨酰胺在理論上本身可以引起ROS產(chǎn)生增加，這豈不引起谷氨酰胺與過度訓練疊加的ROS生成增多而導致機體過氧化損傷增加嗎？我們實驗數(shù)據(jù)表明，補充谷氨酰胺后并不能有效的緩減過度訓練引起的血漿中炎性因子的增加，如IL-6、CINC、G-CSF，卻可以明顯提升由于過度訓練引起的NO的減少，但血漿過氧化水平、MPO及NADPH氧化酶的活性同過度訓練組比較有下降的趨勢。

3.3 中性粒細胞中 iNOS介導產(chǎn)生的 NO與NADPH氧化酶的消長性關系

NO是L-精氨酸和氧分子在誘導性一氧化氮合酶（iNOS）的作用下利用NADPH提供的電子而合成的。補充NO的供體Gln可減少中性粒細胞在血管內皮的黏附而加速其在血管中的移行，同時由于中性粒細胞NO代謝中谷氨酰胺作為氮的供體可增加內源性NO的生成而調控內皮功能信號分子的作用。但由于NO共用NADPH提供電子，NADPH氧化酶與NO之間有相互抵御的消長作用，也就是說中性粒細胞中NADPH氧化酶活性增加會抑制iNOS的活性而減少NO的產(chǎn)生，而NO的過度產(chǎn)生又可抑制機體中NADPH氧化酶活性而減少此途徑產(chǎn)生的ROS，這兩種因素相互抵消的矛盾在最近的 Chen（2010）糖尿病研究報道中也有體現(xiàn)［10］。據(jù)此推測過度訓練時補充Gln在增加NO生成的同時抑制了NADPH氧化酶的活性，從而減少由NADPH氧化酶途徑產(chǎn)生的ROS，而單純補充Gln過度訓練后ROS的生成主要是iNOS介導生成的過量的NO所致。因此運動時單純補充Gln可引起NO的大量生成而出現(xiàn)新的自由基損傷。

3.4 DPI合并Gln補充對過度訓練引起的中性粒細胞功能下降的逆轉作用及機制分析

本研究對大鼠中性粒細胞NADPH氧化酶關鍵亞基gp91phox和p47phox的蛋白表達的檢測表明：DPI合并Gln可適度有效抑制NADPH氧化酶的活性而產(chǎn)生適度的ROS，而過度訓練后而與之有消長關系的血漿NO濃度卻顯著增加，因此我們有理由推測DPI合并Gln補充可能一方面從活性氧產(chǎn)生途徑上抑制中性粒細胞NADPH介導產(chǎn)生過多的ROS，另一方面從Gln固有的對細胞補充能量的角度出發(fā)來實施對細胞免疫的調理作用，而且由于NO與NADPH氧化酶的消長性關系，過度訓練引起的內源性NO的增多也可反饋性降低NADPH氧化酶使兩者達到某種平衡。因此DPI合并Gln補充針對過度訓練引起的血液過氧化水平、中性粒細胞的過度激活，中性粒細胞呼吸爆發(fā)與吞噬功能的降低具有顯著的逆轉作用。

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