17β-雌二醇對大鼠子宮平滑肌自發(fā)和激發(fā)收縮活動的抑制作用*

馬 勤，李紅芳，△，金 姍，豆興成，張英福，張立雪，都中蕊

（1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，2.甘肅省新藥臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000）

雌性動物進(jìn)入初情期后，子宮會在孕激素和雌激素作用下，發(fā)生有規(guī)律的周期性變化。隨動情周期不斷進(jìn)行，子宮肌層出現(xiàn)不同頻率、強(qiáng)度、形式的收縮運(yùn)動。從卵泡早期至黃體早期子宮內(nèi)膜運(yùn)動逐漸活躍［1］，排卵后子宮運(yùn)動逐漸減弱，至分泌中晚期甚至消失［2］。這種自律性收縮運(yùn)動的變化規(guī)律倍受科研工作者關(guān)注。通過對子宮肌層收縮模式的探究，獲得其收縮規(guī)律，有助于判斷胚胎容受性，提高妊娠率，了解不孕癥病因等。

另有文獻(xiàn)報道，17β-雌二醇（17β-estradiol，EST）可顯著抑制小腸平滑肌收縮運(yùn)動，且與雌二醇劑量成正比［3］；17β-雌二醇還可抑制膽囊平滑肌的收縮［4］；抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖與運(yùn)動［5］等。然而，17β-雌二醇作用于子宮平滑肌的研究并不多見。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，主要實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菫榱搜芯亢吞接?7β-雌二醇作用于處在不同月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜變化狀態(tài)下子宮平滑肌的影響，用以闡釋17β-雌二醇對不同時期子宮平滑肌收縮變化的作用及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

前列腺素 F2α（prostaglandin F2α，PGF2α）和 17β-雌二醇購自 Sigma公司，溶解于二甲亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO，上海金山化工廠出品）。每個樣品浴槽中DMSO終濃度不超過0.1%，且對子宮平滑肌基本收縮效應(yīng)無干擾。

1.2 方法

1.2.1 肌條準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)選用35只健康SD大鼠（蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），體重200～250 g，雌性。實(shí)驗(yàn)動物禁食一夜（12 h），飲水不限。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天將大鼠擊昏，迅速剖開腹腔，剪取子宮約1.5 cm，立即置于含 Krebs液（單位：mmol／L，成分：NaCl 120.6，KCl 5.9，NaH2PO41.2，MgCl21.2，NaHCO315.4，CaCl22.5，及葡萄糖 11.5，緩沖 pH 7.4）培養(yǎng)皿中，使用鈍性分離法剝離粘膜，將其切割并制成肌條（5 mm×10 mm），然后用棉線將子宮肌條固定于L形通氣溝上，另一端與張力換能器相連于串聯(lián)灌流實(shí)驗(yàn)裝置上，肌肉標(biāo)本分別懸掛于含（37±0.5）℃ Krebs液的恒溫灌流肌槽中，保持1.5 g靜息張力。在容積為5 ml的灌流肌槽中通入混合氣體：95%O2和5%CO2，每20 min更換溶液，穩(wěn)定30 min后累積加入 17β-雌二醇，使肌槽內(nèi)藥物終濃度分別為：0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0μmol／L，加藥間隔5 min。張力換能器可將子宮平滑肌的收縮運(yùn)動轉(zhuǎn)換為電子信號，并通過BL-420E＋生物功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（TME，中國）進(jìn)行記錄。計算給藥前1 min大鼠子宮平滑肌的張力（g）、收縮波平均振幅（g）和頻率（b／min）的降低百分比（%）作為對照值，每次給藥后數(shù)值作為效應(yīng)值，給藥前張力以靜息張力值計算。同步取子宮進(jìn)行通過HE染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為四組（將同一只大鼠子宮肌條分配到不同加藥組）：（1）EST組；（2）KCl＋EST組；（3）EST對 CaCl2誘發(fā)子宮平滑肌收縮組；（4）PGF2α＋EST組。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以平均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)誤（ˉx±sˉx）表示，組間各參數(shù)變化用單因素方差分析，并采用 t顯著性檢驗(yàn)。用線性回歸法計算半抑制濃度（IC50），半效應(yīng)濃度（EC50）及相應(yīng)pD2值。

2 結(jié)果

2.1 子宮平滑肌收縮的三種基本波形與子宮周期變化的關(guān)系

大鼠子宮平滑肌的收縮運(yùn)動并不規(guī)律，隨月經(jīng)周期的變化，出現(xiàn)三種不同收縮形式：一部分子宮平滑肌條表現(xiàn)出典型的位相性收縮（圖1A），即：收縮波波形緊密、均勻，振幅穩(wěn)定、持續(xù)；另一部分平滑肌條收縮曲線表現(xiàn)為明顯的緊張性運(yùn)動（圖1B），即：沒有位相收縮波出現(xiàn)，肌肉收縮僅表現(xiàn)為張力變化；還有一部分子宮平滑肌條收縮活動不規(guī)律（圖1C），即：子宮平滑肌條收縮波不緊密，時有時無，隨著時間的推移，收縮波振幅減小、頻率降低，逐漸消失。

Fig.1 Sample traces showed the phasic contraction（A），the tonic contraction（B）and the untypical contraction（C）of uterine smooth muscle in rats

2.2 17β-雌二醇對大鼠子宮平滑肌自發(fā)性節(jié)律收縮活動的影響

在表現(xiàn)為自發(fā)節(jié)律位相性收縮的肌條中，17β-雌二醇（圖2）可濃度依賴性地降低大鼠子宮平滑肌靜息張力和節(jié)律性收縮頻率，并減小其收縮波的振幅（表 1）。

Fig.2 Sample traces treated with ESTof uterine smooth muscle in rats（n＝9）

Tab.1 Effects of EST on spontaneous rhythmic contractions of uterine smooth muscle in rats（n＝9）

2.3 17β-雌二醇對KCl激發(fā)大鼠子宮平滑肌收縮活動的影響

在表現(xiàn)為緊張性收縮的肌條中，大鼠子宮平滑肌條經(jīng)KCl溶液激發(fā)平衡后，依次累積加入梯度濃度的EST（圖3）溶液，可濃度依賴性地降低緊張性收縮張力（表2）。用線性回歸法計算子宮平滑肌條單獨(dú)加入 EST后的 IC50為 7.278μmol／L，pD2＝-0.862。

Fig.3 Sample traces treated with KCl and EST of uterine smooth muscle in rats（n＝9）

Tab.2 Effects of ESTon contractions stimulated by KCl of uterine smooth muscle in rats（n＝9）

2.4 17β-雌二醇對子宮平滑肌在無 Ca2＋Krebs液中CaCl2量效曲線的影響

累積濃度的CaCl2溶液可使子宮平滑肌條出現(xiàn)明顯劑量依賴性收縮。用50.0μmol／L的EST溫育子宮平滑肌條后，CaCl2量效收縮曲線明顯右移，最大收縮振幅與對照相比顯著降低（圖4）。用線性回歸法計算子宮平滑肌條加入 CaCl2的EC50為1.422×10-3mol／L，pD2＝2.847（對照組）；EC50為 3.028×10-3mol／L，pD2＝2.519（EST組）。

Fig.4 Inhibitory actions of EST on Ca2＋-dependent contractile responses（A，B）and effects of EST on the Ca2＋-dependent contractile responses of uterine smooth muscle in the Ca2＋free Krebs solution（C）（n＝9）

2.5 17β-雌二醇對 PGF2α激發(fā)大鼠子宮平滑肌收縮活動的影響

PGF2α可激發(fā)處于緊張性收縮及非典型肌肉收縮狀態(tài)的子宮平滑肌，使之產(chǎn)生節(jié)律位相性收縮波；PGF2α也可改變處于位相性子宮平滑肌收縮波的張力、振幅、頻率。大鼠子宮平滑肌條經(jīng)濃度為10-6mol／L的 PGF2α溶液激發(fā)平衡后，依次累積加入梯度濃度EST（圖5）溶液，可濃度依賴性地降低激發(fā)收縮波的張力、振幅、頻率（表3）。

Fig.5 Sample traces treated with PGF2α and EST of uterine smooth muscle in rats（n＝5）

3 討論

雌激素的生物學(xué)作用可通過基因組機(jī)制（ge-nomic mechanism）和非基因組機(jī)制（nongenomic mechanism）來實(shí)現(xiàn)的。有學(xué)者［6］認(rèn)為，雌激素與雌激素受體（ER）結(jié)合后，上述兩種機(jī)制可相互協(xié)同發(fā)揮作用，共同作用于子宮平滑肌細(xì)胞。在心血管平滑肌、氣道平滑肌以及腦神經(jīng)等組織細(xì)胞中，雌激素可通過非基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制影響 Ca2＋激活K＋通道、L型電壓Ca2＋通道、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)酶（extracellular signal regulated kinase，Erk）通路［6］和肌醇三磷酸的生成等環(huán)節(jié)來改變細(xì)胞內(nèi)游離Ca2＋濃度，調(diào)節(jié)平滑肌的收縮以及神經(jīng)內(nèi)分泌等生理功能。在本實(shí)驗(yàn)中，EST抑制子宮平滑肌自發(fā)性節(jié)律收縮，使其基礎(chǔ)張力呈下降趨勢、降低子宮平滑肌收縮振幅，減小其收縮波頻率。該抑制作用具有劑量依賴關(guān)系，且肌條在中、高濃度EST作用下，收縮抑制現(xiàn)象可在1 min內(nèi)出現(xiàn)，提示該抑制作用并不是作用于胞內(nèi)受體，而是由非基因組機(jī)制引起。另有研究顯示：在機(jī)體其他的部位存在雌激素的Gs蛋白偶聯(lián)受體，雌激素作用于膜上的G蛋白偶聯(lián)受體，使胞內(nèi)cAMP升高，激活cAMP依賴性的蛋白激酶，引起相應(yīng)蛋白質(zhì)磷酸化，引起細(xì)胞的功能活動發(fā)生變化，如神經(jīng)細(xì)胞膜、心肌細(xì)胞膜等。而本實(shí)驗(yàn)中17β-雌二醇作用于子宮平滑肌的即時效應(yīng)可能也與胞漿內(nèi)cAMP濃度升高，胞膜對Ca2＋的通透性降低有關(guān)，但需要進(jìn)一步的證實(shí)。

Tab.3 Effects of EST on contractions stimulated by PGF2αof uterine smooth muscle in rats（n＝5）

Ca2＋是引起平滑肌收縮的關(guān)鍵物質(zhì)，胞外Ca2＋內(nèi)流主要通過肌細(xì)胞膜上的電壓依賴性鈣通道（PDC）和受體操控式鈣通道（ROC），外 Ca2＋內(nèi)流可改變平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度，引起肌細(xì)胞收縮。胞外高K＋可使平滑肌細(xì)胞去極化，L-型PDC開放，胞外Ca2＋內(nèi)流，從而導(dǎo)致平滑肌收縮。本實(shí)驗(yàn)中，17β-雌二醇抑制KCl激發(fā)子宮平滑肌條緊張性收縮運(yùn)動，還可抑制子宮平滑肌在無Ca2＋Krebs液中CaCl2量效曲線，使曲線發(fā)生右移，此作用主要與胞膜對Ca2＋的通透性降低有關(guān)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：17β-雌二醇可抑制子宮平滑肌自發(fā)和激發(fā)收縮活動，其作用可能主要通過抑制電壓依賴性鈣通道介導(dǎo)的胞外Ca2＋內(nèi)流實(shí)現(xiàn)。

PGF2α在體內(nèi)參與許多生理過程，如眼壓的調(diào)節(jié)、腎臟濾過功能和血管收縮等；PGF2α還與糖尿病、骨質(zhì)疏松及月經(jīng)紊亂等病癥相關(guān)，但PGF2α與女性生殖系統(tǒng)的關(guān)系問題備受關(guān)注。在子宮內(nèi)膜上，縮宮素（oxytocin，OT）啟動了 PGF2α的大量釋放過程［7］，過量的PGF2α引起子宮痙攣性收縮而導(dǎo)致痛經(jīng)，且痛經(jīng)的程度與PGF2α水平呈正相關(guān)。有文獻(xiàn)表明，子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EMs）患者的前列腺素（PGs）含量顯著高于正常婦女［8］。另外，隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)性激素和性激素受體可能在內(nèi)異癥的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用［9］。本實(shí)驗(yàn)中，17β-雌二醇抑制 PGF2α激發(fā)子宮平滑肌條收縮運(yùn)動的張力、振幅及頻率。因此，17β-雌二醇有可能緩解由PGF2α分泌過量引起的痛經(jīng)現(xiàn)象，以及抑制子宮內(nèi)膜異位癥病灶的生長。

17β-雌二醇具有較強(qiáng)臨床應(yīng)用潛能，其應(yīng)用具有醫(yī)學(xué)實(shí)踐意義。絕經(jīng)綜合征和絕經(jīng)相關(guān)疾病的發(fā)生與絕經(jīng)后婦女卵巢功能衰退、雌激素分泌水平降低有著密不可分的關(guān)系，雌激素替代治療即是防治這類疾病的主要措施之一。更受關(guān)注的是雌性動物進(jìn)入初情期后，隨著下丘腦——垂體——卵巢軸激素調(diào)節(jié)出現(xiàn)發(fā)情周期，每一發(fā)情周期過程中，在垂體分泌的促性腺激素、卵巢中卵泡分泌的孕激素和雌激素作用下，子宮發(fā)生有規(guī)律的周期性變化［10］。從卵泡早期開始，子宮內(nèi)膜運(yùn)動發(fā)生率增加，直至黃體早期。在此過程中，雌激素可調(diào)節(jié)子宮平滑肌及輸卵管的收縮運(yùn)動，調(diào)節(jié)胚子及胚胎的運(yùn)行，子宮內(nèi)膜增生期雌激素水平與子宮內(nèi)膜蠕動頻率呈正相關(guān)；卵泡晚期及黃體早期子宮內(nèi)膜運(yùn)動由活躍變安靜，有助于精子定向運(yùn)動及胚胎著床［1］。排卵后由于體內(nèi)孕激素水平增高，子宮內(nèi)膜運(yùn)動功能逐漸減弱，至分泌中晚期甚至消失［2］，這是因?yàn)樵屑に匾种屏姿崦窩活性，阻斷部分前列腺素合成，從而抑制子宮及輸卵管的收縮［1］，這也有助于胚胎在宮腔內(nèi)順利著床。本實(shí)驗(yàn)中，處于發(fā)情周期不同階段的大鼠，其子宮平滑肌收縮運(yùn)動也不規(guī)律，隨月經(jīng)周期的變化，出現(xiàn)三種不同收縮形式：位相性收縮、緊張性收縮、以及不規(guī)則收縮。位相性運(yùn)動波形出現(xiàn)的子宮平滑肌血管分布不豐富，HE染色判斷子宮周期處于增殖晚期和分泌早期。該期切片觀察：腺泡變大，部分腺泡出現(xiàn)內(nèi)陷趨勢，腺泡上皮細(xì)胞長桿狀，細(xì)胞核開始變成圓形，間質(zhì)細(xì)胞排列致密。緊張性運(yùn)動波形出現(xiàn)的子宮平滑肌血管分布較為豐富，HE染色觀察子宮周期處于分泌期后期。該期腺體大而延伸，呈現(xiàn)橢圓形或啞鈴形，腺泡上皮細(xì)胞核旁有空泡形成，部分細(xì)胞有頂漿分泌，間質(zhì)細(xì)胞呈圓形，有較多螺旋血管排布。而不規(guī)則波形出現(xiàn)的子宮肌條，HE染色觀察子宮周期處于月經(jīng)期和增殖期早期。該期切片觀察：功能層腺體裂開，有崩塌現(xiàn)象，間質(zhì)細(xì)胞聚集，有少量嗜中性粒細(xì)胞出現(xiàn)；部分切片觀察腺泡形狀小而圓，腺泡上皮細(xì)胞核呈長桿狀，間質(zhì)細(xì)胞排列很致密。這一“周期階段——子宮收縮模式”對應(yīng)規(guī)律的研究，對了解哺乳動物受精、著床等機(jī)制，以及促進(jìn)人類胚胎工程技術(shù)的發(fā)展有著重要的科研及實(shí)踐意義。

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