低溫暴露對真皮微血管內(nèi)皮細胞功能的影響*

曹燕卿，楊丹鳳，張競丹，李 曦，安玉林，劉嘉瀛，汪 海

（軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所，天津300050）

人體只有維持適宜的體溫，才能保持正常的生理功能。當機體溫度降低時，機體不可避免地出現(xiàn)各種變化，對機體的器官、組織和細胞的功能產(chǎn)生較大影響。如果冷環(huán)境的作用強度超出人體體溫的調(diào)控能力，將引起人體局部或全身的溫度改變，甚至造成全身或局部的冷損傷［1，2］。以往通過動物凍傷模型和主動脈血管內(nèi)皮細胞冷凍暴露模型研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細胞是冷誘導凍傷發(fā)生的重要靶點和始動因素［3，4］，但是不同低溫暴露?？蓪е缕つw出現(xiàn)不同的病理變化［2］，而關于不同低溫暴露致皮膚血管內(nèi)皮損傷機制的研究鮮有報道，因此本研究擬通過體外建立大鼠真皮微血管內(nèi)皮細胞（dermal microvasvcular endothelial cells，DMVECs）低溫暴露模型，進一步探討冷誘導皮膚病變的相關機制，為冷損傷預防及冷習服機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級Wistar大鼠乳鼠（軍事醫(yī)學科學院動物中心），MCDB131培養(yǎng)基、II型中性蛋白酶（美國sigma公司），I型膠原酶、Trizol試劑（美國 Gibco公司），Percoll溶液（美國 Pharmacia公司），胎牛血清（美國Hyclone公司），ECGS（美國 Upstate公司），真皮微血管內(nèi)皮細胞鑒定試劑盒（武漢Pricell公司），乳酸脫氫酶檢測試劑盒（南京建成），PCR引物（上海invitrogen公司），PCR相關試劑（北京TIANGEN公司）。

1.2 主要儀器

常溫及低溫細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），低溫細胞培養(yǎng)箱為本室設計（通5%CO2，21%O2，74%N2），酶標儀（瑞士 Tecan公司），PCR儀、紫外凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Red公司），DNA電泳設備（北京六一儀器廠）。

1.3 大鼠真皮微血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)與鑒定［5］

取新生乳鼠斷椎處死后于無菌條件下剪取背皮，放入含雙抗的PBS溶液中浸泡10 min，使用眼科彎鑷刮除皮下脂肪層后剪成2 cm×3 cm皮片，將表皮面朝下浸于2.5 mg／ml II型中性蛋白酶溶液中4℃消化過夜，撕除表皮，將真皮片剪碎放入4 mg／ml I型膠原酶溶液中37℃震蕩消化45 min，待消化完全過100目細胞篩，1 500 r／min離心10 min，洗滌細胞沉淀2次后將細胞濃度調(diào)至2×106cells／ml。制備不連續(xù)密度梯度Percoll分離液，將上述細胞混懸液加入Percoll分離液上方，2 000 r／min離心20 min，吸取20%與30%交界處的細胞移至MCDB131培養(yǎng)基（含 15%胎牛血清，15μg／ml ECGS，1μg／ml氫化可的松）中，放入5%CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通過形態(tài)學觀察及真皮微血管內(nèi)皮細胞鑒定試劑盒進行細胞鑒定。

1.4 低溫暴露模型構(gòu)建及分組

選取2～3代細胞進行實驗，分別在37℃、28℃、12℃及0℃條件下，同步建立不同低溫溫度暴露模型，并以37℃組為對照，暴露時間均為24 h。

1.5 細胞形態(tài)學觀察

取2～3代生長良好的DMVECs細胞，以1×106cells／ml接種于六孔培養(yǎng)板中，不同溫度暴露24 h后取出，置倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化情況，拍照記錄。

1.6 細胞培養(yǎng)液中LDH活性測定

取2～3代生長良好的DMVECs，以1×106cells／ml接種至六孔板中，每組設3個復孔。不同低溫條件下分別培養(yǎng)24 h后，收集各孔細胞培養(yǎng)上清液，依照LDH試劑盒說明書立即測定各孔培養(yǎng)液中LDH活性。

1.7 RT-PCR測定VEGF表達

取2～3代生長良好的DMVECs，以1×106cells／ml接種至六孔板中，每組六孔。每2個孔提取一個mRNA樣本?？俁NA的提取嚴格按Trizol試劑說明書操作，紫外分光光度計測定其純度并定量。使用TIANScript RT Kit完成各組cDNA的合成。PCR反應體系為：2μl cDNA，2μl引物，6μl ddH2O，10μl 2×PCR Reagent。VEGF上游引物 5’-CAGGGAAGACAATGGGATGA-3’， 下 游 引 物 5’-AGGAAGTGGGGTAGGGAGAG-3’，產(chǎn)物大小為 470 bp；βactin引物上游 5’-CAGGTCATCACTATCGGCAA-3’，下游引物 5’-AAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3’，產(chǎn)物大小為430 bp。以上引物均由Invitrogen公司合成。反應條件：采用降落 PCR法：（1）94℃5 min；（2）94℃30 s，60℃40 s，每循環(huán)降低 0.2℃，72℃延伸 50 s，30個循環(huán)；（3）72℃10 min。將擴增的PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖電泳。采用凝膠成像系統(tǒng)灰度掃描檢驗各個條帶的積分吸光度值，以VEGF和β-actin灰度的比值做半定量分析。

1.8 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學處理，兩組間比較采用 t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠DMVECs的鑒定

培養(yǎng)第5天，細胞融合至90%～95%，呈現(xiàn)典型的“鵝卵石樣”結(jié)構(gòu)（圖1A），于第三代時采用 FITC標記的血小板內(nèi)皮細胞粘附因子-1（platelet／endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1／CD31）進行細胞免疫熒光染色鑒定細胞，發(fā)出綠光的即為微血管內(nèi)皮細胞，結(jié)果表明細胞呈陽性（圖1B）。

2.2 不同溫度暴露對大鼠DMVECs形態(tài)的影響

經(jīng)不同溫度暴露24 h后，與37℃組（圖2A）比較，28℃組（圖 2B）及 12℃組（圖 2C）細胞形態(tài)由“鋪路石樣”變?yōu)椤俺衫w維細胞樣”，細胞間未出現(xiàn)明顯間隙，0℃組細胞則出現(xiàn)明顯的皺縮（圖2D）。提示低溫能夠引起DMVECs細胞形態(tài)改變，0℃則對其形態(tài)造成了直接破壞。

Fig.1 Rat dermal microvascular endothelial cells culture

Fig.2 Change of cell morphology with different temperatures in rat dermal microvascular endothelial cells

2.3 不同溫度暴露對大鼠DMVECs細胞膜完整性的影響

不同溫度暴露24 h后，28℃、12℃及0℃組細胞培養(yǎng)液中 LDH活性（U／L）分別為 54.17±3.02，64.66±3.03，82.13±10.91，較 37℃組（12.23±3.03）顯著提高（P＜0.01，圖 3），12℃組及 0℃組較28℃組 LDH活性增強（P＜0.05），但 0℃組與 12℃組比較無明顯差異。

Fig.3 LDH leakage from rat dermal microvascular endothelial cells under the different temperatures（ˉx±s，n＝3）

2.4 不同溫度暴露對大鼠DMVECs的VEGF表達影響

與37℃比較，28℃及 12℃暴露 24 h后可使DMVECs VEGF mRNA表達上調(diào)，37℃組VEGFmRNA的相對表達量為 0.64±0.01，28℃組、12℃組的相對表達量分別為 0.86±0.04和 1.04±0.04，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而0℃組的相對表達量為0.64±0.01，與 37℃組比較無統(tǒng)計學差異（圖 4）。

Fig.4 Effects of different temperatures on expression of VEGF mRNA in DMVECs（ˉx±s，n＝3）

3 討論

大量的實驗證明，皮下血管內(nèi)皮細胞是機體冷應激反應最先做出應答的部位，同時是冷致皮膚病變過程中的主要靶點［3］。冷應激初期，其可通過合成釋放血管舒張因子（如一氧化氮）與局部交感神經(jīng)共同調(diào)控皮下血管的收縮與舒張［1］，從而保證核心體溫維持在37℃，減少體內(nèi)能量散失，而長時間的低溫暴露則可直接造成其功能紊亂，如一氧化氮（NO）合成減少、內(nèi)皮素-1（ET-1）及其受體 ETA表達增高［1］，免疫粘附分子表達增多，致使皮下血管持續(xù)收縮、血流淤滯、血管阻塞、免疫細胞沉積，引發(fā)局部微循環(huán)障礙［4］，最終導致皮膚病變的發(fā)生。另外，不同低溫持續(xù)暴露可使皮膚出現(xiàn)不同的改變［2］，當皮膚溫度降至29℃時，機體即可感到不適；降至28℃以下時，人體感覺到寒冷；降至17℃以下時，機體出現(xiàn)疼痛感，此時可發(fā)生凍瘡；當溫度降至12℃以下時，麻木感出現(xiàn)并可導致浸漬足或戰(zhàn)壕足的發(fā)生；而在8℃以下則徹底失去痛覺感受，至0℃即刻，皮下微血管系統(tǒng)即可出現(xiàn)明顯的形態(tài)學改變與亞細胞結(jié)構(gòu)改變，至-2℃以下，皮膚及皮下血管即可發(fā)生凍結(jié)并出現(xiàn)變性，導致凍傷的發(fā)生。以上現(xiàn)象提示不同溫度持續(xù)暴露致皮膚病變的機制可能存在差異。但以往關于冷致皮下血管內(nèi)皮細胞病變的機制研究多采用動物模型在0℃以下進行［6］，在細胞水平上對其機制進行闡明的報道較少［4］，因此，將真皮微血管內(nèi)皮細胞暴露于不同低溫溫度一定時間后對其相關性質(zhì)的改變進行比較，能夠更好的揭示不同低溫暴露誘導皮膚病變的機制。

我們的研究結(jié)果顯示，0℃作用24 h后，微血管內(nèi)皮細胞呈明顯的皺縮形態(tài)，其胞外LDH活力較37℃組升高近7倍，但其VEGF表達與37℃組沒有差異；而28℃及12℃組細胞雖形態(tài)變?yōu)椤俺衫w維狀”，但未出現(xiàn)明顯皺縮，其胞外LDH活力提高的同時胞內(nèi)VEGF mRNA表達也較37℃及0℃組出現(xiàn)上調(diào)。通常，細胞形態(tài)可間接反映細胞骨架完整性，LDH常用作反映細胞膜完整性及通透性。對血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的研究顯示，其作為血管內(nèi)皮細胞重要的內(nèi)源性細胞因子，其表達上調(diào)將有益于細胞增殖、細胞存活［7］、細胞骨架維持及血管新生等過程，但同時可造成血管內(nèi)皮細胞通透性提高［8］，另外，研究發(fā)現(xiàn)低溫暴露可引起心肌細胞VEGF表達上調(diào)［9］，刺激棕色脂肪組織 VEGF表達，增強機體冷習服能力［10］。結(jié)合本實驗結(jié)果，提示28℃及12℃暴露過程中微血管內(nèi)皮細胞VEGF的表達上調(diào)可能對細胞骨架的維持起保護作用，抑制細胞形態(tài)趨向皺縮，但同時又不可避免的增強了細胞膜通透性，導致LDH外漏增多；而0℃組細胞形態(tài)皺縮明顯，其 VEGF表達與37℃組比較卻沒有差異，提示0℃能夠直接對內(nèi)皮細胞骨架造成破壞，致使胞膜完整性喪失，導致LDH漏出程度嚴重。

綜上，我們推測，0℃組可能通過直接破壞真皮微血管內(nèi)皮細胞骨架及膜完整性，導致皮膚凍傷的發(fā)生，這與文獻報道［4］一致；而皮下溫度降至12℃左右時，機體皮膚表現(xiàn)出的發(fā)紅水腫，則可能是皮膚微血管內(nèi)皮細胞在冷刺激下代償性增強VEGF表達的結(jié)果，其在維持內(nèi)皮細胞形態(tài)，保證血管完整性的同時，提高血管內(nèi)皮通透性。說明，機體長期暴露于正常皮溫（＜33℃）以下的溫度導致的皮膚病理變化機制與0℃誘發(fā)凍傷的機制存在明顯不同，但皮膚微血管內(nèi)皮細胞在低溫時如何調(diào)控其VEGF表達，尚不明確，通過闡明這一機制，將為我們預防和治療非凍結(jié)溫度導致的皮膚病變，加快和增強機體冷習服能力奠定基礎。

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