視黃酸和三碘甲腺原氨酸在減輕睡眠剝奪損害認(rèn)知功能中的作用*

張 娜，馬 強(qiáng)，陳學(xué)偉，徐傳香，安改紅，崔 博，佘曉俊

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津300050）

當(dāng)前，隨著社會(huì)的發(fā)展，生活節(jié)奏的加快，工作模式的轉(zhuǎn)換和工作壓力的增大，越來越多的人們處于一種潛在的睡眠剝奪（sleep deprivation，SD）狀態(tài)。持續(xù)性工作狀態(tài)所導(dǎo)致的SD對(duì)人的認(rèn)知功能及工作能力的影響，一直是現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)及許多行業(yè)（如航空、航海、救援、運(yùn)輸、醫(yī)療等）所關(guān)注的問題。有研究顯示，24 h的SD使人的認(rèn)知能力下降30%～40%，持續(xù)48 h，認(rèn)知能力下降達(dá)60%～70%［1］。

神經(jīng)顆粒素（neurogranin，Ng）是神經(jīng)元特異性的突觸后膜蛋白，在腦內(nèi)主要分布于海馬、前額皮層、紋狀體和杏仁核等與認(rèn)知功能高度相關(guān)的重要腦區(qū)［2］。大量研究報(bào)道，Ng是參與調(diào)控學(xué)習(xí)記憶過程的一個(gè)重要蛋白，參與了學(xué)習(xí)記憶過程中起核心作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及突觸可塑性的主要調(diào)控環(huán)節(jié)［3］。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ng在SD損害認(rèn)知功能過程中可能發(fā)揮重要作用［4］。上調(diào)Ng的表達(dá)有可能減輕 SD對(duì)認(rèn)知功能的損害。

維生素A（vitamin A，VA）是人體必需的重要微量營(yíng)養(yǎng)素，它在人體的視覺、免疫、生長(zhǎng)發(fā)育及細(xì)胞分化等方面發(fā)揮著廣泛的生理學(xué)效應(yīng)。甲狀腺激素（thyroid hormones，TH）具有維持正常生長(zhǎng)發(fā)育、促進(jìn)代謝和產(chǎn)熱、提高神經(jīng)興奮性的作用。最近，有報(bào)道VA的活性代謝物-視黃酸（retinol acid，RA）和TH的活性形式-三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine，T3）與海馬突觸可塑性和認(rèn)知功能相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RA和T3可通過其相應(yīng)的核受體調(diào)控Ng基因的表達(dá)［5］。因此，本研究觀察在72 h SD時(shí)補(bǔ)充RA或T3能否通過上調(diào)Ng的表達(dá)進(jìn)而有效減輕SD對(duì)認(rèn)知功能的損害，為尋找預(yù)防或緩解SD損害認(rèn)知功能的有效措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量180～220 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，給予12 h光照／12 h黑暗（光照時(shí)間為 6∶00～18∶00），自由飲食及進(jìn)水，飼養(yǎng)室的溫度 （18～24℃）和濕度 （55%）相對(duì)較為恒定。大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組（n＝6）：即72 h對(duì)照組（72 h C組），72 h睡眠剝奪＋生理鹽水組（72 h SD組），72 h睡眠剝奪＋RA組（72 h SD＋RA組）和72 h睡眠剝奪＋T3組（72 h SD＋T3組）。

1.2 動(dòng)物模型

睡眠剝奪箱［6］由兩個(gè)60 cm×20 cm×60 cm有機(jī)玻璃箱組成，底部通過一個(gè)直徑為46 cm的轉(zhuǎn)盤相連。轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)速為每圈10 min，SD側(cè)的轉(zhuǎn)盤下底盤中水深2～3 cm，水溫保持在20℃左右，大鼠只能在轉(zhuǎn)盤上活動(dòng)，瞌睡時(shí)轉(zhuǎn)盤和箱側(cè)壁會(huì)將其擠下水中，從而達(dá)到SD的目的；對(duì)照組一側(cè)的轉(zhuǎn)盤下底盤中不放水，大鼠可以在轉(zhuǎn)盤上和底盤中自由活動(dòng)，保證正常睡眠。其間自由進(jìn)食、飲水，自然晝夜光照。每次將兩只大鼠稱重后放入睡眠剝奪箱的兩側(cè)，一側(cè)為SD組，另一側(cè)為對(duì)照組。干預(yù)組的大鼠于SD前一天開始腹腔注射 RA或 T3（150μg／kg），1次／天，持續(xù)4 d。

1.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)裝置為高50 cm，底邊為100 cm×100 cm的無蓋方箱，底面平均分為25個(gè)方格。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，將大鼠置于方箱底面中心，記錄大鼠3 min內(nèi)在箱底的穿行格數(shù)和直立次數(shù)。兩次實(shí)驗(yàn)之間清洗方箱周壁及底面，以免上次動(dòng)物余留的信息影響下次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 海馬齒狀回LTP誘發(fā)實(shí)驗(yàn)

大鼠用 20%烏拉坦腹腔注射（1.5 g／kg），待動(dòng)物麻醉后，固定于腦立體定位儀上，常規(guī)手術(shù)暴露顱骨，記錄電極定位于海馬的齒狀回顆粒細(xì)胞層（前囟后 3.5 mm，中縫旁 2.0 mm，硬腦膜下 3.5 mm）；刺激電極定位于同側(cè)海馬穿行通路上（前囟后8.0 mm，中縫旁4.0 mm，硬腦膜下3.0 mm）。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，先用中等刺激電壓的單刺激（interval＝30 s，duration＝200μs）誘發(fā)齒狀回產(chǎn)生群峰電位（population spike，PS），記錄至少30 min，使PS幅值達(dá)到穩(wěn)定。調(diào)節(jié)刺激電壓，使PS幅值達(dá)最大值，再下調(diào)刺激電壓，使PS保持在其最大峰值的50%，固定此刺激電壓。用單刺激，記錄每5 min內(nèi)引出10個(gè)PS的平均值，共記錄30 min。然后，用高頻刺激（high frequency stimulation，HFS）：2 s內(nèi) 10次 internal＝5 ms，duratio n＝200μs，trains＝5的復(fù)合串刺激，誘發(fā) LTP。HFS之后，再用HFS前的單刺激，記錄每5 min內(nèi)PS的平均值，共記錄60 min。以HFS前5min內(nèi)的PS均值為100%，HFS前后各時(shí)間點(diǎn)記錄的PS均值與之比較，以百分?jǐn)?shù)（%）表示。

1.5 Western blot檢測(cè)海馬Ng的蛋白表達(dá)

海馬稱重后置于腦組織蛋白提純緩沖液中（20 mmol／L Tris-Hcl pH 7.0，1 mmol／L EDTA，1%Triton-100，0.5%PMSF）低溫勻漿，14 000 r／min離心 15 min，取上清，用BCA法測(cè)蛋白含量并分裝，-20℃保存，用于Western blot檢測(cè)Ng表達(dá)。將提取的腦組織蛋白（10μg）加2×SDS上樣緩沖液（總體積為10 μl）經(jīng)95℃變性10 min；上樣于10%SDS聚丙烯酰胺（Sigma）凝膠中電泳 1.5 h；用半干轉(zhuǎn)膜儀（北京六一）將蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF膜（millipore）上，約 60 min。10%脫脂奶粉溶液于室溫封閉1 h，TBST漂洗3次×10 min；加入羊抗人 Ng抗體（1∶500，Santacruz）室溫1 h后 4℃過夜，TBST漂洗 3次 ×10 min；加入HRP-抗羊 IgG（1∶5 000，Santacruz）室溫孵育 1 h，TBST漂洗3次×10 min；加ECL發(fā)光顯色劑，暗室內(nèi)壓片（Kodak）；用洗脫緩沖液洗PVDF膜30 min。同法顯示HRP標(biāo)記的GAPDH單克隆抗體（1∶10 000，上?？党桑?。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，統(tǒng)計(jì)處理用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，各組采用單因素方差（one-way ANOVA）分析進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 RA和T3干預(yù)對(duì)72 h睡眠剝奪大鼠曠場(chǎng)行為的影響

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，72 h SD后，大鼠站立次數(shù)有降低趨勢(shì)，穿行格數(shù)顯著降低（P＜0.05）。腹腔注射RA和T3的大鼠較SD組站立次數(shù)有增多趨勢(shì)、穿行格數(shù)顯著增加（P＜0.05），接近C組的水平。提示RA和T3可以使72h SD大鼠自發(fā)行為和探究活動(dòng)增加，緩解了神經(jīng)系統(tǒng)的抑制狀態(tài)（圖1，2）。

2.2 RA和T3干預(yù)對(duì)72 h睡眠剝奪大鼠海馬齒狀回LTP的影響

高頻刺激前，各組的PS峰幅值無顯著性差異（P＞0.05）。高頻刺激后，PS峰增加幅值均明顯升高，出現(xiàn)LTP。與C組比較，SD組的PS峰升幅較?。≒＜0.05，P＜0.01），腹腔注射 RA和 T3的 SD組，PS峰升幅較SD組顯著增高（P＜0.05），并且與C組無顯著性差異。C組、SD組、SD＋RA組和SD＋T3組的 PS峰幅值分別為171.8%±14.7%，142.2%±5.7%，158.6%±8.1%和 166.1%±9.3%（圖 3）。

Fig.1 Effects of RA and T3 on the rearing number in open field test after 72 h SD in ratss，n＝6）

Fig.2 Effects of RA and T3 on the crossing number in open field test after 72 h SD in ratss，n＝6）

Fig.3 Effects RA and T3 on the LTPin DGof rats after 72 h SD in rats（n＝6）

2.3 RA和T3干預(yù)對(duì)72 h睡眠剝奪大鼠海馬Ng蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果見圖4。72 h SD＋RA組和72 h SD＋T3組大鼠海馬Ng蛋白表達(dá)水平較72 h SD組顯著升高（P＜0.05），均與C組無顯著性差異（圖5）。表明腹腔注射RA和T3可以有效上調(diào)SD后海馬中下降的Ng蛋白水平。

Fig.4 Western blot analysis of Ng levels in the hippocampus of rats

Fig.5 Effects of RA and T3 on hippocampus neuronal Ng protein expression after 72 h SD in ratss，n＝6）

3 討論

大量研究表明，SD使機(jī)體認(rèn)知功能明顯受損，如學(xué)習(xí)、記憶能力下降，反應(yīng)遲鈍，注意力分散，定向障礙，出現(xiàn)幻覺［7，8］等，但其具體的機(jī)制尚未完全闡明。前期研究發(fā)現(xiàn)，Ng及其PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有可能是SD損害認(rèn)知功能的重要機(jī)制之一，SD可能通過影響中樞海馬中以Ng為上游調(diào)控子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而損害機(jī)體的學(xué)習(xí)記憶功能［4］。據(jù)此，有可能定位進(jìn)行干預(yù)調(diào)控的有效作用靶點(diǎn)，預(yù)防和減輕SD對(duì)認(rèn)知功能的危害。

VA是一種有著廣泛生理學(xué)和藥理學(xué)活性的重要微量營(yíng)養(yǎng)素，在體內(nèi)主要通過其活性代謝產(chǎn)物RA調(diào)節(jié)其核受體而發(fā)揮作用。有研究顯示RA不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，而且在成人CNS中也發(fā)揮重要作用［9］。海馬中RA含量在大腦各區(qū)位居首位，是RA合成活力非常強(qiáng)的區(qū)域。

RA主要通過兩大類視黃酸受體（retinoic acid receptors，RAR）（a，β，γ）和 （retinoid X receptors，RXR）（a，β，γ）調(diào)控靶基因表達(dá)。這些受體是 DNA結(jié)合蛋白，被特殊的類維生素A配體激活后，通過與靶基因特異的啟動(dòng)序列相互作用引起基因的轉(zhuǎn)錄。在許多表達(dá)受RA調(diào)控的基因中，有一些編碼自身的核受體，有一些編碼在突觸可塑性中起重要作用的腦特異性蛋白質(zhì)—Ng［10］。基因敲除實(shí)驗(yàn)表明這些受體和某些編碼神經(jīng)蛋白（如Ng）的基因在海馬LTP形成中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)在成年嚙齒類動(dòng)物中，隨著年齡的增長(zhǎng)或者食物中VA被剝奪，RAR表達(dá)水平明顯下降，而RAR的低表達(dá)可使Ng mRNA及Ng蛋白表達(dá)水平明顯下降。外源補(bǔ)充RA則可以減輕因衰老或VA缺乏引起的記憶功能減退，并且可以逆轉(zhuǎn)RAR低表達(dá)狀態(tài)，進(jìn)而提高Ng mRNA及Ng的表達(dá)。Ling L等研究發(fā)現(xiàn)外源性補(bǔ)充RA可以通過上調(diào)Ng mRNA和蛋白的表達(dá)，使腦梗塞的缺血面積明顯減少，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

TH具有多種生理作用，它調(diào)節(jié)著機(jī)體正常的行為、認(rèn)知和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，對(duì)哺乳動(dòng)物的腦發(fā)育及其功能成熟具有廣泛而重要的影響。研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺功能紊亂會(huì)影響動(dòng)物海馬發(fā)育期的突觸功能，并且損害甲狀腺功能正常的成年動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能。對(duì)甲狀腺切除的成年鼠進(jìn)行電生理和生化的研究表明，由TH缺乏造成的記憶損傷與海馬CA1區(qū)的LTP損傷有關(guān)。TH常常控制著多種基因的表達(dá)，這些基因又調(diào)控著突觸可塑性和記憶形成的各種形式。

JMunoz等篩選大鼠腦的cDNA文庫時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)在TH缺少時(shí)mRNA水平明顯降低的神經(jīng)特異性基因—Ng［11］。TH對(duì)哺乳動(dòng)物大腦的發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)作用，而Ng基因是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)由于缺乏TH而在mRNA水平的表達(dá)發(fā)生顯著改變的神經(jīng)細(xì)胞基因。在發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，Ng的基因表達(dá)受TH調(diào)節(jié)，TH能夠影響Ng蛋白在神經(jīng)元內(nèi)的最后積聚量，但不影響其基因的表達(dá)方式，且這種調(diào)節(jié)是可逆的。甲狀腺機(jī)能減退的大鼠，腦組織內(nèi)的Ng mRNA表達(dá)水平明顯下降，這一變化可被外源性給予T3糾正，T3與核受體（T3R）相結(jié)合，然后通過T3應(yīng)答元件（TRE）與靶基因相結(jié)合共同作為轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)基因的表達(dá)。對(duì)成年甲狀腺功能減退大鼠Ng mRNA表達(dá)水平進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，Ng的表達(dá)也發(fā)生可逆性的降低：大鼠大腦皮層Ng mRNA水平降低近30%，而在紋狀體中則降低約50%。甲狀腺機(jī)能減退后Ng的變化不僅體現(xiàn)在mRNA水平上，在皮層、紋狀體和海馬部位的Ng蛋白均較對(duì)照組降低［12］。

據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)選取外源性補(bǔ)充RA和T3作為干預(yù)因素，觀察二者能否上調(diào)SD后Ng的表達(dá)量，以及能否有效緩解或?qū)筍D對(duì)大鼠的神經(jīng)行為和LTP的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腹腔注射RA和T3可以有效地上調(diào)SD后海馬中下降的Ng蛋白量，使大鼠自發(fā)行為和探究活動(dòng)增加，緩解神經(jīng)系統(tǒng)的抑制狀態(tài)，并且明顯消除或減輕SD對(duì)海馬神經(jīng)突觸可塑性和神經(jīng)元興奮性的損傷作用。研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)Ng在SD損害認(rèn)知功能中的重要作用并為尋找預(yù)防或緩解SD損害認(rèn)知功能的有效措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ Buguet A，Moroz DE，Radomski MW.Modafinil-medical considerations for use in sustained operations［J］.Aviat Space Environ Med，2003，74（6 pt 1）：659-663.

［2］ Ran X，Miao HH，Sheu FS，et al.Structural and dynamic characterization of a neuron-specific protein kinase C substrate，neurogranin［J］.Biochemistry，2003，42（17）：5143-5150.

［3］ Zhabotinsky AM，Camp RN，Epstein IR，et al.Role of the neurogranin concentrated in spines in the induction of longterm potentiation［J］.J Neurosci，2006，26（28）：7337-7347.

［4］ 張 娜，劉洪濤.不同睡眠剝奪時(shí)間對(duì)大鼠海馬和前額皮層 Ng、PKC、CaMKⅡ mRNA表達(dá)的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2009，25（7）：1355-1359.

［5］ Husson M，Enderlin V，Alfos S，et al.Expression of neurogranin and neuromodulin is affected in the striatum of vitamin A-deprived rats［J］.Brain Res Mol Brain Res，2004，123（1-2）：7-17.

［6］ Bernard MB，Clete AK，Carol AE，et al.Sleep deprivation in the rat：Ⅱ.Methodology［J］.Sleep，1989，12（1）：5-12.

［7］ 李硯鋒，詹 皓，李 彤，等.48 h睡眠剝奪對(duì)正常人雙重任務(wù)能力和疲勞感的影響［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2005，21（2）：174-175.

［8］ 王 鑫，李衛(wèi)星，李金艷，等.睡眠剝奪對(duì)焦?fàn)t工人神經(jīng)行為的影響［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2012，12（6）：700-702.

［9］ Malik MA，Blusztajn JK，Greenwood CE.Nutrients as trophic factors in neurons and the central nervous system：role of retinoic acid［J］.J Nutr Biochem，2000，11（1）：2-13.

［10］ Iniguez MA，Morte B，Rodriguez-Pena A，et al.Characterization of the promoter region and flanking sequences of the neuron-specific gene RC3（neurogranin）［J］.Brain Res Mol Brain Res，1994，27（2）：205-214.

［11］ Dong J，Yin H，Liu W，et al.Congenital iodine deficiency and hypothyroidism impair LTPand decrease C-fos and C-jun expression in rat hippocampus［J］.Neurotoxicology，2005，26（3）：417-426.

［12］ Manzano J，Morte B，Scanlan TS，et al.Differential effects of triiodothyronine and the thyroid hormone receptor beta-specific agonist GC-1 on thyroid hormone target genes in the brain［J］.Endocrinology，2003，144（12）：5480-5487.