大腸埃希菌強毒力島致病機制研究進展

盧 琴，嚴玉霖，高 洪，高利波，趙 汝，李祥峰，邵志勇，臧雅婷，崔艷艷

（云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，云南昆明650201）

大腸桿菌病是由致病性大腸埃希菌（E.coli）引起的急性腸道傳染病的總稱。大腸埃希菌是動物腸道共生菌的正常組分。通過其他的致病菌和基因重組發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，特別是己獲得毒力基因的大腸埃希菌菌株能在人和動物間引起大范圍的腸道或腸道外感染［1］。在豬和牛，腸道外大腸埃希菌能引起新生幼畜敗血癥死亡［2］。一般來說，大腸埃希菌通常不致病，但當宿主免疫力下降或細菌移位侵入腸道外組織器官時，可引起宿主感染，嚴重的甚至可導(dǎo)致敗血癥、新生兒腦膜炎。強毒力島（High pathogeniticity island，HPI）首先發(fā)現(xiàn)于耶爾森菌，因此被命名為耶爾森菌強毒力島。耶爾森菌HPI廣泛分布于腸道致病菌中，主要含有與鐵攝取有關(guān)的毒力基因簇，編碼參與合成及攝取鐵載體耶爾森菌素（yersiniabactin）的鐵抑制蛋白irp（iron-repressible protein）基因及其調(diào)控基因，行使鐵攝取功能，細菌只有通過強有力的鐵攝取機制從宿主攝取鐵元素，才有可能在宿主機體內(nèi)生存，使宿主發(fā)病來介導(dǎo)感染過程。其核心功能區(qū)的irp2-irp1-ipr3-irp4-irp5-fyuA基因簇被稱為irp2-fyuA基因簇，是參與合成介導(dǎo)鐵攝取功能系統(tǒng)的鐵載體耶爾森桿菌素的主要基因組分，它們在不同類型的耶爾森菌中高度保守，編碼參與合成及攝取耶爾森鐵載體的基因及其調(diào)控基因，行使鐵攝取功能，增強細菌在宿主體內(nèi)存活的概率［8］，與機體的致病性密切相關(guān)。HPI的各基因水平轉(zhuǎn)移與缺失等的差異，以及不同的腸道致病菌及其種屬間的HPI的攜帶的不同，使其大腸埃希菌的致病越發(fā)復(fù)雜。而大腸埃希菌的致病機制包括兩部分，一部分為毒力因子，主要為黏附素系統(tǒng)（菌毛、非菌毛黏附素、F1、P、F17等）、鐵離子攝取系統(tǒng)（氣桿菌素、腸桿菌素）和外膜蛋白；另一部分為分子致病機制，其主要是編碼染色體上的毒力因子基因，如耶爾森菌HPI、腸細胞脫落位點（LEE）毒力島、OI毒力島等?，F(xiàn)就致病性大腸埃希菌HPI的致病性研究現(xiàn)狀做一綜述。

1 基本特征

HPI的全序列由Rakin于1999年2月測定并公布［3］，長為43 493bp，其基本特征為：編碼載有耶爾森菌素與毒力相關(guān)性的基因且僅存在于強毒株，如小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Y.enterocolitica，Yen）中僅有1B生物型才具有完整的Yen HPI；G＋C mol%與耶爾森菌染色體有明顯差異（一般高于）；大的染色體片段（大于35kb）；為一緊密、明確的遺傳學單位，兩端通常為順向重復(fù)序列DR17；一側(cè)外緣與asn tRNA基因相連；載有“可移動”的基因［4-5］。但Yen HPI具有相對的穩(wěn)定性，而現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的毒力島則具有不穩(wěn)定性的特點。且耶爾森菌HPI與大腸埃希菌之間能存在水平轉(zhuǎn)移。

耶爾森菌HPI是細菌重要的致病因素，也是大腸埃希菌重要的毒力因子，其中irp2為鐵調(diào)節(jié)蛋白，是HPI的標志基因。在實際應(yīng)用中可針對irp2設(shè)計特異性引物，對己經(jīng)過生化鑒定為大腸埃希菌的菌株，提取DNA，以此DNA為模板PCR方法擴增出特異性條帶后，其大小與設(shè)計的irp2片段大小進行比較，以此來檢測此菌株是否含有HPI。

2 分子致病機制

2.1 耶爾森菌HPI

最早用來描述泌尿道致病性大腸埃希菌的2個相對分子質(zhì)量很大的、編碼許多毒力相關(guān)基因不穩(wěn)定的染色體DNA片段，能在大腸埃希菌間發(fā)生水平轉(zhuǎn)移?，F(xiàn)大量的研究表明，HPI能介導(dǎo)細菌的致病性，含有HPI的菌株致病性強于沒有HPI的菌株。王斌等［6］的研究表明，在耶爾森菌中，HPI毒力島的存在與其致病性密切相關(guān)，含HPI毒力島Ybt的功能失活直接導(dǎo)致菌株致小鼠毒性明顯下降，說明了HPI決定著細菌毒力或致病力的強弱。Schubert S等［7］研究表明共軛轉(zhuǎn)移和同源DNA重組在不同類別的大腸埃希菌的毒力島的水平轉(zhuǎn)移起重要作用。

呂殿紅等［8］用攜帶有HPI的大腸埃希菌對雛鴨進行致病性試驗，結(jié)果表明，同樣基因型的HPI所表現(xiàn)出來的致病性的強弱有所區(qū)別。魏文康等［9］的試驗結(jié)果表明，大腸埃希菌HPI相關(guān)毒力因子的攜帶情況不盡一致，進行同源性比較，而irp2、fyuA、tsh和iucD基因與GenBank中的參考序列同源性很高，但iss基因序列卻有差異，因而認為在細菌進化過程中發(fā)生了較大程度的變異，而且在不同動物源的大腸埃希菌中發(fā)生了水平傳遞。徐繼英等［10］證實了耶爾森菌HPI在奶牛乳腺炎源大腸埃希菌中廣泛流行分布，但也存在差異，而不同血清型菌株攜帶HPI的傾向性可能只與特定的血清型有一定的關(guān)系。鐵離子對所有微生物都是必需的營養(yǎng)成分，并且作為基本酶反應(yīng)體系的成分，參與體內(nèi)有氧代謝、電子轉(zhuǎn)運過程、DNA或RNA的合成等。細菌只有通過強有力的鐵攝取機制從宿主奪取鐵無素，而在一個限鐵的環(huán)境下，特異性的建立起高度親合性的鐵攝取系統(tǒng)，通過釋放稱為鐵載體的小分子物質(zhì)來應(yīng)對許多缺鐵性的生長環(huán)境，然后它們利用特異性的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)再攝取這些螯合了鐵的鐵載體［11］，從而有利于細菌的生長?？梢栽谠囼炛杏糜需F或無鐵的情況下觀察細菌的生長狀況，從而反映鐵在細菌生長過程中所起的作用，來更進一步地揭示其致病機理。目前常用CAS［12］（鉻天青S）平板法來檢測是否有鐵載體的參與，其機理為將強配體L（如鐵載體）加入到深染的鐵染料復(fù)合物中，一旦此鐵配體復(fù)合物形成釋放游離的染料，有顏色變化。（FeDye3-λ＋Lκ-FeL3-κ＋Dyeλ-），而在無鐵的情況下觀察鐵的表達量，主要是通過SDS-PAGE方法，在2-2′-聯(lián)吡啶（鐵螯合劑，可以結(jié)合培養(yǎng)基中的鐵離子，使細菌生長環(huán)境處于鐵缺乏狀態(tài)）終濃度為0.2mmol／L的狀態(tài)下，加入50μL甘油凍存的HPI陽性菌株，于10mL LBD培養(yǎng)基中，37℃200r／min培養(yǎng)18h～24h，最后配制60g／L分離膠和50g／L濃縮膠進行SDS-PAGE凝膠電泳。通過對比分析HPI的攝鐵能力。Garemax A等［13］研究結(jié)果表明通過胚胎載體攝鐵對腸道外致病性大腸埃希菌的毒力有很大的作用，因為需要外膜蛋白的參與，可以構(gòu)建一個位點來制備疫苗來控制動物的腸道外致病性大腸埃希菌等傳染病。李葉芳等［14］通過試驗證實了禽致病性大腸埃希菌中強毒力島的攝鐵能力與其致病性有密切的聯(lián)系。耶爾森菌HPI的致病性通常是與機體的攝鐵系統(tǒng)聯(lián)合起來的，一般來說，HPI的主要作用作用在于機體在缺鐵的情況下，能通過鐵載體攝鐵，從而行使致病作用。

2.2 腸細胞脫落位點（LEE）毒力島

大腸埃希菌的致病性，主要通過菌體與腸黏膜上皮細胞的緊密黏附，致使腸上皮細胞微絨毛消失，細胞骨架發(fā)生改變，絲狀肌動蛋白聚集等組織病理學損傷，這種損傷稱為黏附與脫落（A／E）。引起A／E損傷的所有基因都位于大腸埃希菌基因組被稱為腸細胞脫落位點（LEE），又稱為LEE毒力島。這些基因主要包括編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)（esc或sep），分泌型蛋白質(zhì)（esp）及其分子伴侶；緊密素易位受體（tir）和外膜蛋白緊密素（eae）等基因。Ⅲ型分泌系統(tǒng)是許多病原菌用來分泌毒力蛋白或把這些蛋白直接注入宿主細胞以啟動生化信息傳導(dǎo)［15］；espB可以通過細菌表面與細胞之間的通路到達宿主細胞［16］，主要是運輸一些毒力蛋白；緊密素是一個雙功能分子，能在形成A／E損傷時作為細胞黏附到緊密素易位受體，同時又能增加黏膜應(yīng)答時的免疫病理。

3 小結(jié)及展望

大腸埃希菌血清型眾多，易繼發(fā)感染，其流行地域性強，耐藥性突出，暴發(fā)率高［17］。毒力島作為細菌染色體上一段具有典型結(jié)構(gòu)特征的基因簇，與多種致病毒力因子的產(chǎn)生和細菌的進化有密切的關(guān)系［18］。毒力島的發(fā)現(xiàn)使我們對細菌的致病性有了更進一步地認識，也了解到大腸埃希菌致病是由多方面因素作用的最終表現(xiàn)。從引起的病變來看，都不是一個因素作用的結(jié)果。因此，在以后的研究過程中，研究兩種或兩種以上的致病因素，將成為了解大腸埃希菌致病機制的突破口。氣候、應(yīng)激、機體本身狀況等變化都將導(dǎo)致機體發(fā)病，所以在實際生產(chǎn)中應(yīng)從各方面考慮，以便更好地預(yù)防大腸桿菌病的流行。大腸埃希菌的致病機制較復(fù)雜，大腸埃希菌HPI各基因的水平，以及在不同菌株中的分布率的不同，以及大腸埃希菌血清型與HPI陽性率的相關(guān)性，可以通過HPI與其相關(guān)的致病機制聯(lián)合起來進行研究，對于認識細菌的進化規(guī)律、闡明病原菌的致病機理，以及認識和預(yù)測新發(fā)傳染病等方面有著重要的意義。

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