美洲大蠊中氨基葡萄糖類化合物的含量測(cè)定

黃 麗，楊永壽，李夸巧，楊興彪，肖培云

（大理學(xué)院云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000）

美洲大蠊（Periplaneta americana）為昆蟲(chóng)綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲(chóng)，俗稱“蟑螂”，首見(jiàn)于《本草綱目拾遺》，也稱其為石姜、滑蟲(chóng)、偷油婆，茶婆子，灶螞子等。其入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》〔1〕，近幾年來(lái)，隨著我國(guó)對(duì)傳統(tǒng)中醫(yī)藥資源研究開(kāi)發(fā)的重視，目前以美洲大蠊為原料的多個(gè)產(chǎn)品相繼研發(fā)成功，如“康復(fù)新滴劑”〔2〕、“心脈龍注射液”〔3〕、“肝龍膠囊”〔4〕等系列新藥。

文獻(xiàn)報(bào)道，美洲大蠊中含有大量的氨基葡萄糖類化合物〔5〕，氨基葡萄糖是葡萄糖的一個(gè)羥基被一個(gè)氨基取代的化合物，俗稱氨基糖，氨基葡萄糖分為硫酸氨基葡萄糖（如硫酸軟骨素）和鹽酸氨基葡萄糖兩種。氨基葡萄糖最重要的用途是構(gòu)成軟骨蛋白多糖的主要成分之一。硫酸軟骨素（Chondroitin Sulfate，ChS）是一種天然酸性黏多糖，由D－葡萄糖醛酸和N－乙酰－D－氨基半乳糖以1，3－糖苷鍵結(jié)合的雙糖為基本單位聚合而成〔6〕，它屬于氨基葡萄糖類化合物，具有多種生物活性，有抗病毒、抗腫瘤、抗凝血、降血脂及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能〔7-12〕等重要生物活性，目前已得到了廣泛的重視和研究，并已應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和保健食品等行業(yè)〔13〕。有文獻(xiàn)〔14〕報(bào)道硫酸軟骨素的含量測(cè)定可用AHMT（4-氨基-3-肼基-5-巰基-1，2，4-三唑）法，其原理為AHMT與己糖醛酸或硫酸軟骨素，在氧化劑KIO4的堿性溶液中，AHMT與ChS生成紫色的衍生物，在540 nm波長(zhǎng)處通過(guò)測(cè)定該衍生物的吸光度來(lái)測(cè)定ChS的含量，根據(jù)此原理，可用AHMT法來(lái)測(cè)定美洲大蠊中氨基葡萄糖類化合物的含量，為美洲大蠊的進(jìn)一步研究提供檢測(cè)方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU-1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），電子恒溫水浴箱（DZKW-4，上?？莆鲈囼?yàn)儀器廠），電子分析天平（AL204-IC，梅特勒-托利多儀器上海有限公司），傅立葉紅外光譜儀（Nicolet 380FT-IR，美國(guó)Nicolet儀器公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-3000A，上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥 美洲大蠊藥材采自云南省大理州彌渡縣5家不同的養(yǎng)殖場(chǎng)，分別編號(hào)為：20120827、20120302、20120415、20120727、20121126，硫酸軟骨素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：140792-201001），AHMT（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司），其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取硫酸軟骨素對(duì)照品250 mg，置50 mL量瓶中，加1 mol/L的KOH溶解，定容，搖勻，即得5 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取約0.5 g脫脂后的美洲大蠊粉末，置50 mL的比色管中，加入4 mol/L的NaOH溶液17.5 mL，于40℃的水浴鍋中溫浸1 h，取出，冷卻，定容至25 mL，過(guò)濾，精密移取續(xù)濾液10 mL，加入1%（g/mL）的活性炭脫色，過(guò)濾，即得供試品溶液。

2.1.3 AHMT溶液的配制 稱取0.50 gAHMT，加0.5 mol/L的HCl溶液溶解，于100 mL量瓶中定容，即得濃度為5 g/L的AHMT溶液。

2.1.4 KIO4溶液的配制 稱取1.00 gKIO4，加0.2 mol/L的KOH溶液溶解，于100 mL量瓶中定容，即得濃度為10 g/L的KIO4溶液。

2.2 吸收波長(zhǎng)的選擇 分別精密移取“2.1.1”、“2.1.2”項(xiàng)下的對(duì)照品、供試品溶液各0.5 mL，分置10 mL量瓶中，加2 mol/L的KOH溶液3 mL，再加5 g/L的AHMT溶液3 mL〔13〕，密塞，混勻，置90 ℃水浴鍋中加熱25 min，取出，冷卻，加10 g/L的KIO4溶液1 mL，定容至刻度，搖勻，以顯色后的4 mol/L NaOH溶液作空白，在400～800 nm波長(zhǎng)下掃描，得吸收光譜曲線。結(jié)果表明，對(duì)照品和供試品溶液在540 nm處均有最大吸收。見(jiàn)圖1。

2.3 對(duì)照品和供試品的紅外光譜比較 取“2.1.2”項(xiàng)下制備的供試品溶液，冷凍干燥，得美洲大蠊氨基葡萄糖提取物。分別取一定量的對(duì)照品和提取得到的供試品，在相同條件下進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)。結(jié)果表明，供試品與對(duì)照品具有相似的紅外吸收光譜。見(jiàn)圖2。

圖1 對(duì)照品和供試品的紫外吸收光譜圖

圖2 對(duì)照品和供試品的紅外吸收光譜圖

2.4 提取條件考察 本試驗(yàn)對(duì)NaOH溶液的濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度和顯色時(shí)間5個(gè)因素進(jìn)行考察。

2.4.1 NaOH溶液濃度考察 精密稱取約0.5 g脫脂后的美洲大蠊粉末，置50 mL的比色管中，按料液比為1∶35加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、

4.5 mol/L的NaOH溶液后，按“2.1.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下的方法顯色，以顯色后的4 mol/L NaOH溶液作空白，在540 nm波長(zhǎng)處用1 cm比色皿測(cè)定溶液吸光度，結(jié)果表明，當(dāng)NaOH溶液的濃度為4 mol/L時(shí)，美洲大蠊中氨基葡萄糖類化合物的含量最高。

2.4.2 料液比考察 精密稱取約0.5 g脫脂后的美洲大蠊粉末，置50 mL的比色管中，按1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45比例加入4 mol/L的NaOH溶液后，按“2.4.1”項(xiàng)下的方法處理，結(jié)果表明，當(dāng)料液比為1∶35時(shí)，測(cè)得美洲大蠊中氨基葡萄糖類化合物的含量最高。

2.4.3 提取時(shí)間考察 精密稱取約0.5 g脫脂后的美洲大蠊粉末，置50 mL的比色管中，按1∶35比例加入4 mol/L NaOH溶液，在40 ℃下提取0.5、1、2、3、4、5、6、7 h后，按“2.4.1”項(xiàng)下的方法處理，結(jié)果表明，當(dāng)提取時(shí)間為1 h時(shí)，美洲大蠊中氨基葡萄糖類化合物的含量達(dá)到最大值，所以選擇提取時(shí)間為1 h。

2.4.4 提取溫度考察 精密稱取約0.5 g脫脂后的美洲大蠊粉末，置50 mL的比色管中，按1∶35比例加入4 mol/L NaOH溶液，分別在30、40、50、60、70 ℃下溫浸1 h后，按“2.4.1”項(xiàng)下的方法處理，結(jié)果表明，當(dāng)提取溫度為40℃時(shí)，美洲大蠊中氨基葡萄糖類化合物的含量最高。

2.4.5 顯色時(shí)間考察 精密移取“2.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液0.5 mL（n=7），分別置10 mL量瓶中，按“2.4.1”項(xiàng)下的方法處理，結(jié)果表明，當(dāng)顯色時(shí)間為25 min時(shí)，吸光度值最大。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密移取“2.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液0.05、0.15、0.25、0.40、0.65、0.75 mL，分別置10 mL量瓶中，按“2.4.1”項(xiàng)下的方法處理，以吸光度A為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品溶液的濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=1.9914C+0.0114，r=0.9998，結(jié)果表明硫酸軟骨素在0.025～0.375 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密移取“2.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液0.5 mL，置10 mL的量瓶中，按“2.4.1”項(xiàng)下的方法處理，連續(xù)測(cè)定6次，記錄吸光度值，計(jì)算RSD值，RSD為0.15%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取“2.1.2”項(xiàng)下的供試品溶液0.5 mL，置10 mL的量瓶中，按“2.4.1”項(xiàng)下的方法處理，間隔30 min測(cè)定1次吸光度，連續(xù)考察4 h，RSD值為1.92%，結(jié)果表明供試品溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取約0.5 g脫脂后的美洲大蠊粉末，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下的方法顯色，以顯色后的4 mol/L NaOH溶液作空白，于540 nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果表明，美洲大蠊中氨基葡萄糖類化合物的平均含量為180.35 mg/g，RSD為3.11%（n=5）。

2.5.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的美洲大蠊粉末（已脫脂）約0.3 g，分別加入7 mL“2.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下的方法顯色，以顯色后的4 mol/L NaOH溶液作空白，于540 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算美洲大蠊中氨基葡萄糖類化合物的平均回收率。見(jiàn)表1。2.6 供試品測(cè)定 分別精密稱取批號(hào)為20090827、20100302、20100415、20110727、20121126 的 樣 品 ，每個(gè)批號(hào)3份，每份約0.5 g，按“2.4”項(xiàng)下考察得到的最佳條件制備供試品溶液，按最佳顯色條件測(cè)定。見(jiàn)表2。

表1 美洲大蠊中氨基葡萄糖類化合物的回收率測(cè)定（n=6）

3 討論

硫酸軟骨素的含量測(cè)定方法有比色法〔15〕、咔唑比色法〔16〕、間苯三酚法〔17〕、AHMT法〔14〕等，但比色法和咔唑法操作繁瑣、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度較差，所以目前主要采用AHMT法，該法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性好、回收率高。硫酸軟骨素屬于氨基葡萄糖類化合物，所以也可用AHMT法來(lái)測(cè)定美洲大蠊中氨基葡萄糖類化合物的含量。

由單因素考察可得，提高NaOH溶液的濃度有助于黏多糖的提取，但隨著NaOH濃度的提高，提取液顏色略加深，同時(shí)有異味出現(xiàn)，這是由于在濃堿作用下，部分蛋白的糖肽鍵斷裂，并釋放出單糖分子，處于糖鏈還原端的糖基在堿性條件下，逐漸生成間糖酸和異糖酸而脫落，脫落的糖類物質(zhì)發(fā)生副反應(yīng)，產(chǎn)生顏色和異味，同時(shí)黏多糖分子量變小〔18〕。

表2 供試品測(cè)定結(jié)果（n=5）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，美洲大蠊藥材中氨基葡萄糖類化合物的含量存在較大差異，不同批次的藥材中氨基葡萄糖類化合物的含量不同，這可能與美洲大蠊藥材的喂養(yǎng)飼料、生長(zhǎng)環(huán)境、養(yǎng)殖時(shí)間不同有關(guān)，因此必須進(jìn)行美洲大蠊藥材的規(guī)范化養(yǎng)殖（GAP）研究，制定統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP），最終實(shí)現(xiàn)美洲大蠊藥材的規(guī)范化養(yǎng)殖。

〔1〕孫星衍.神農(nóng)本草經(jīng)〔M〕.北京：商務(wù)印書館，1955：90.

〔2〕蔣永新，王熙才，金從國(guó)，等.康復(fù)新體外誘導(dǎo)胃癌BGC-823細(xì)胞調(diào)的亡實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，27（2）：5-9.

〔3〕田雙雙，陳光勇，劉光明.心脈龍的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2009，18（16）：14.

〔4〕杜一民，陳鴻珊，李樹(shù)楠，等.治療乙型肝炎新藥肝龍膠囊的藥效學(xué)初步研究〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（8）：1369-1371.

〔5〕耿福能，張樂(lè)，陳開(kāi)曉，等.一種以美洲大蠊為原料制備氨基葡萄糖鹽酸鹽的方法：中國(guó)，102633844A〔P〕.2012-08-15.

〔6〕張莉.硫酸軟骨素含量測(cè)定方法的研究進(jìn)展〔J〕.天津藥學(xué)，2013，25（2）：44-46.

〔7〕張珣，王靜鳳，李輝，等.海參硫酸軟骨素抑制小鼠Lewis肺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移作用的研究〔J〕.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2011，33（6）：597-601.

〔8〕劉武.硫酸軟骨素藥理作用研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)藥業(yè)，2008，17（8）：64.

〔9〕姚曉燕.黃鱔骨硫酸軟骨素多糖降血脂功能研究〔J〕.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，8（30）：31-33.

〔10〕楊勇，陳旭，昝中學(xué)，等.鹽酸氨基葡萄糖聯(lián)合硫酸軟骨素治療腰椎小關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的臨床觀察〔J〕.華西醫(yī)學(xué)，2012，27（12）：1809-1813.

〔11〕謝小冬，蘇剛，輦曉峰，等.硫酸軟骨素-A對(duì)X射線輻照損傷小鼠的保護(hù)作用〔J〕.西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，49（1）：86-91.

〔12〕戴小慧，章建芳，陳龍.硫酸軟骨素免疫增強(qiáng)作用研究〔J〕.中國(guó)藥業(yè)，2006，15（16）：16-17.

〔13〕Zhou S.Health food useful for improving water content of skin，obtained by mixing components including hyaluronic acid，chondroitin sulfate，fish collagen，vitaminC powder，glycine，proline，extract of grape seeds and starch：China,102210425A〔P〕.2011-10-12.

〔14〕劉坤，高華.AHMT分光光度法測(cè)定軟骨魚(yú)類硫酸軟骨素〔J〕.中國(guó)海洋藥物志，2005，24（4）：21-23.

〔15〕蘇玉永，王虎，李曉華.比色法測(cè)定復(fù)方硫酸軟骨素膠囊中硫酸軟骨素的含量〔J〕.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2006，26（3）：351-352.

〔16〕周葉，趙婷，馮偉偉，等.咔唑法測(cè)定中華鱘軟骨中硫酸軟骨素的含量〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（19）：11597-11598.

〔17〕王亞，陳彥，胡玲，等.硫酸軟骨素制備工藝的優(yōu)化〔J〕.中國(guó)生化藥物雜志，2006，21（1）：12-14.

〔18〕李建武，肖能應(yīng)，余瑞元，等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法〔M〕.北京：北京大學(xué)出版社，1994：125-165.