弱陽離子磁珠聯(lián)合MALDI-TOFMS技術檢測腎盂尿路上皮癌血清差異蛋白

董德鑫，李漢忠，石冰冰，張玉石，徐維鋒

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科，北京100730)

腎盂尿路上皮癌術前診斷困難，需要與腎盂里的凝血塊和息肉等進行鑒別，而尿找瘤細胞等確診陽性率較低［1］。本研究利用基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜技術(matrix assisted laser desorption ionization time of flightmass spectrometry，MALDI-TOFMS)比較腎盂尿路上皮癌組和對照組的血清樣本，尋找對于腎盂尿路上皮癌具有鑒別意義的血清差異蛋白峰，彌補尿找瘤細胞陽性率不高的缺點，提高腎盂尿路上皮癌的術前診斷率。

1 材料與方法

1.1 研究對象:腎盂尿路上皮癌組:2010年12月至2011年4月期間，于北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科病房采集腎盂癌患者術前血清樣本共計16例，其中男性10例，女性6例，年齡范圍54～79歲，平均70.3歲。所有患者均行腹腔鏡腎盂癌根治術，術后病理確診為腎盂尿路上皮癌。對照組:采集非腎盂癌對照組術前標本共計11例，均為男性，年齡范圍34～77歲，平均52.5歲。術后病理確診為腎囊腫4例，腎結石4例，良性前列腺增生3例。

1.2 標本收集:清晨空腹狀態(tài)抽取肘靜脈血3～5 mL，置入真空無抗凝劑BD采血管，2 000 r/min，離心10 min后吸取上層血清，分裝入艾本德管后置于－80℃低溫冰箱凍存。

1.3 實驗步驟:200μL樣品管加入10μL磁珠結合緩沖液、10μL磁珠和5μL血清吸打混勻，分離后加入100μL磁珠清洗緩沖液，重復上述步驟兩次，加入5μL磁珠洗脫緩沖液，分離后將上清液移入新的0.5μL樣品管，加入5μL磁珠穩(wěn)定緩沖液并吸打混勻。

取1μL標準品與10μL基質混合，后取1μL混合液點在Anchorchip靶標準品位置。采用美國AutoflexTMMALDITOF-MS質譜儀，不同結晶點，多點采集，累加5～10個結晶點數(shù)據。取磁珠處理后的樣品，同標準品點樣方法，結果分子量偏差小于100 ppm。

1.4 結果判定:根據整體波形特點，剔除不合格圖譜，并對低分子量區(qū)間波峰分子量進行校正。采集分子質量區(qū)間范圍為1～10 ku，選擇標準品進行分子質量校正。利用Clin-ProTools2.2軟件對質譜圖的數(shù)據進行分析，篩選血清差異蛋白峰，建立腎盂尿路上皮癌的診斷模型。

2 結果

2.1 腎盂尿路上皮癌與對照組之間血清差異蛋白峰篩選:質譜儀采集分子質量區(qū)間1～10 ku范圍內全部可識別蛋白峰127個，凝膠模擬示意圖(圖1)，具有顯著差異的蛋白峰6個，分子質量分別為 4074.14、145.15、7475.45、1546.94、2547.55和4592.11(P＜0.05)。

2.2 遺傳算法建立腎盂尿路上皮癌診斷模型:利用ClinPro-Tools2.2軟件通過遺傳算法優(yōu)化選擇，篩選出符合條件的14個差異蛋白峰建立診斷模型(表1)，交叉驗證后識別能力為100%。

圖1 兩組樣本血清差異蛋白峰凝膠模擬示意圖Fig 1 Gel simulation diagram of differential protein peaks of two samp les of serum

表1 篩選出符合條件的14個差異蛋白峰建立診斷模型Table 1 The diagnosismodel is established by 14 differentially expressed proteins

3 討論

腎盂尿路上皮癌是發(fā)生在腎盂或腎盞上皮的惡性腫瘤，約占所有腎腫瘤的10%左右。本病大多數(shù)為尿路上皮癌，尿路上皮癌可在任何被覆有移行上皮的尿路部位先后或同時出現(xiàn)?；颊甙l(fā)病年齡多在40歲以上，男女比例約為3∶1，左右發(fā)病無明顯差異，雙側發(fā)病者約2% ～4%［2］。

約70%～90%的腎盂移行細胞癌患者早期臨床表現(xiàn)的重要癥狀為無痛性肉眼血尿，少數(shù)病人因腫瘤或凝血塊阻塞腎盂輸尿管而引起腰部不適、隱痛及脹痛。腎盂癌術前診斷困難，尤其與腎盂里的息肉、血塊等良性病變鑒別診斷困難，而尿找瘤細胞等檢查陽性率偏低。腎盂占位的術前診斷不同，采取的手術方式截然不同。

MALDI-TOFMS技術是在新近發(fā)展起來的蛋白質組學新技術，采集的差異蛋白峰分子質量范圍在1～10 Da，結果中許多在統(tǒng)計學上顯著差異的蛋白質分子質量在5000 Da以下，MALDI-TOFMS技術在尋找小分子量差異蛋白上的優(yōu)勢明顯［3］。遺傳算法是近些年發(fā)展起來的一種全局優(yōu)化算法，借用了生物遺傳學的觀點，通過自然選擇、遺傳及變異等作用機制，實現(xiàn)個體的適應性提高。本研究利用ClinPro-Tools2.2軟件對質譜圖的數(shù)據進行分析，就是利用遺傳算法進行組合優(yōu)化，篩選多個差異蛋白峰，建立腎盂尿路上皮癌的診斷模型。該診斷模型敏感性和特異性較高。

本研究是應用蛋白組學對腎盂尿路上皮癌的初步研究，應用蛋白組學技術篩選差異蛋白峰，并建立腎盂尿路上皮癌的診斷模型具有較高的敏感性和特異性，可以彌補尿找瘤細胞陽性率不高的缺陷，有利于腎盂尿路上皮癌的早期診治。

［1］Giebel R，Worden C，Rust SM，et al．Microbial fingerprinting using matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flightmass spectrometry(MALDI-TOF MS)applications and challenges［J］．Adv Appl Microbiol，2010，71:149－184．

［2］Raman JD，Scherr DS．Management of patients with upper urinary tract transitional cell carcinoma［J］．Nat Clin Pract Urol，2007，4:432 －443．

［3］Wong MY，Yu KO，Poon TC，etal．Amagnetic bead-based serum proteomic fingerprintingmethod for parallel analytical analysis andmicropreparative purification［J］．Electrophoresis，2010，31:1721－1730．