IL－HLLME－HPLC法測定酸奶中磺胺類抗生素

張麗媛 王 穎，2 張東杰

（1．黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2．國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

食品中獸藥殘留立法委員會認為獸藥的使用在于保障畜牧業(yè)穩(wěn)步發(fā)展、增加畜牧產(chǎn)品供應(yīng)量、減少因動物疾病而帶來的經(jīng)濟損失，以及控制人畜共患疾病在動物和人類之間傳播等方面［1］。但過量或違規(guī)使用，可造成多種直接和間接的危害，主要表現(xiàn)為變態(tài)反應(yīng)與過敏反應(yīng)、細菌耐藥性、致畸作用、致突變性作用及致癌作用［2，3］。

歐盟和美國食品藥品管理局已經(jīng)提出，乳制品中磺胺類抗生素的總殘留量不得超過100μg／kg，強調(diào)嬰兒配方奶粉中必須完全不含磺胺類抗生素，中國農(nóng)業(yè)部規(guī)定在乳制品中磺胺甲嘧啶和總的磺胺殘留量不得高于25 μg／kg 和100μg／kg［4－6］。目前，乳制品中磺胺類抗生素殘留檢測存在的兩個主要問題：低濃度水平殘留和復(fù)雜基質(zhì)干擾［7］，這就迫切需要建立一種快速、有效、高靈敏度的分析目標分析物的方法。樣品分析成敗的關(guān)鍵是樣品的前處理，固相萃取［8，9］、固相微 萃取、基 質(zhì) 固 相 分 散［10］、分 散 液 液 微 萃 取［11］、濁點萃取［12］等都是新近常用的分析磺胺殘留的樣品前處理方法。一些靈敏度較高的檢測方法也發(fā)展起來，例如高效液相色譜法（HPLC）、質(zhì)譜法［13］等。均相液液微萃取（ILHLLME）是近年來液液微萃取和濁點萃取發(fā)展起來的一種新型萃取技術(shù)，集采樣、萃取、富集于一體，有機溶劑用量非常少。近幾年來，被稱為“綠色溶劑”的離子液體在分離萃取過程中得到了廣泛的應(yīng)用。離子液體是由有機陽離子和無機或有機陰離子構(gòu)成的、在室溫或者室溫附近呈液體狀態(tài)的熔融鹽，它完全由離子組成，可以自由調(diào)節(jié)。用它代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有機溶劑，可以從源頭上克服有機溶劑揮發(fā)性大、毒性強等的缺點；同時離子液體對水和有機物具有結(jié)構(gòu)可調(diào)性，具有選擇性溶解能力。本研究擬采用以離子液體為基礎(chǔ)的IL－HLLME技術(shù)，結(jié)合高效液相色譜法對酸奶樣品中磺胺類抗生素藥物進行分析測定。旨在尋求一種靈敏、綠色的檢測方法。

1 材料與方法

1．1 儀器與試劑

1．1．1 主要儀器

高效液相色譜儀：Agilent1200 型，帶有多波長檢測器，美國安捷倫技術(shù)有限公司；

Eclipse XDB－C18柱：150mm×4．6mm，3．5μm，美國安捷倫技術(shù)有限公司；

超聲振蕩器：KQ2200E型，中國昆山儀器有限公司；

高速離心機：Allegre 64R 型，美國貝克曼公司；

純水凈化儀：Milli－Q 型，法國Millipore公司。

1．1．2 主要試劑

磺胺嘧啶（SD）、磺胺甲基嘧啶（SMI）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺甲噁唑（SMZ）：純度均大于98%，美國Sigma公司（化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1）；

圖1 磺胺類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure1 The chemical structures of sulfonamide antibiotics

乙腈、甲醇：色譜純，美國Fisher公司；

甲酸、磷酸、乙醇、丙酮：分析純，北京化學(xué)試劑廠；

1－乙基－3甲基咪唑四氟硼酸鹽（［C2MIM］［BF4］）、1－丁基－3甲基咪唑六氟磷酸鹽（［C4MIM］［PF6］）：純度＞98%，上海成捷化學(xué)試劑公司；

1－己基－3甲基咪唑六氟磷酸鹽（［C6MIM］［PF6］）：純度＞97%，上海成捷化學(xué)試劑公司；

1－丁基－3甲基咪唑四氟硼酸鹽（［C4MIM］［BF4］）、1－辛基－3甲基咪唑六氟磷酸鹽（［C8MIM］［PF6］）：純度＞99%，上海成捷化學(xué)試劑公司；

磷酸銨（NH4PF6）：98%，上海成捷化學(xué)試劑公司。

1．1．3 樣品

伊利原味、蒙牛原味、完達山原味、龍丹原味4種酸奶樣品：大慶市某超市。

1．2 試驗方法

1．2．1 標準溶液的配制 磺胺嘧啶（SD）、磺胺甲基嘧啶（SMI）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺甲噁唑（SMZ）分別用乙腈溶解，制成500μg／mL的標準溶液，于4 ℃下保存。標準混合溶液濃度為10μg／mL。工作標準溶液通過用乙腈稀釋標準混合溶液獲得，現(xiàn)用現(xiàn)制。

1．2．2 試驗過程 準確移取10mL 酸奶加入10mL 純水，振蕩2 min，混合均勻；取5 mL 混合后的樣品溶液放入10mL的聚四氟乙烯離心管中，依次在離心管中加入20μL磷酸溶液和70μL［C6MIM］［PF6］（萃取劑），混合后強烈振蕩5min。然后加入100μL 的［C4MIM］［BF4］（分散劑），在35 ℃下超聲萃取10min。再準確稱取0．10g的NH4PF6加入到超聲后的樣品溶液中，再次超聲振蕩2min，此時離心管中的溶液形成一個水／分散劑／萃取劑的乳濁液體系，目標分析物迅速地由水相轉(zhuǎn)移到離子液體相并且達到兩相平衡。平衡后的乳濁液在5 ℃，15 000r／min條件下，離心10min，溶液分層，萃取相沉積到離心管的底部。將上部的水相溶液完全吸除，用50μL 微量注射器將離子液體相完全轉(zhuǎn)移到1．0mL的離心管中，再用0．1%甲酸的乙腈溶液稀釋到200μL作為目標分析溶液，將此分析溶液均勻超聲2 min，過0．22μm 濾膜后，進行HPLC分析。

1．2．3 色 譜 條 件 色 譜 柱：Eclipse XDB－C18色 譜 柱（150mm×4．6mm，3．5μm）；柱溫：35 ℃；流動相：A（0．1%甲酸的乙腈溶液）和B（pH 3，0．1%甲酸的水溶液），梯度洗脫條件見表1；流動相流速：0．5 mL／min；進樣量：20μL；檢測波長：265nm；參比波長和狹縫寬度分別為360，4nm。

表1 梯度洗脫時間程序Table1 Time procedure of gradient elution

2 結(jié)果與討論

2．1 萃取條件的優(yōu)化

2．1．1 樣品溶液pH 值的影響 由于溶液的pH 值會影響磺胺類抗生素的電離狀態(tài)和溶解度，也會影響酸奶樣品中蛋白質(zhì)的沉淀情況，所以試驗考察樣品溶液的pH 值。在強酸和強堿條件下磺胺類抗生素的溶解度很大，萃取率較低，故選取pH 值在3．0～9．0范圍進行考察。由圖2可知，當pH

表3 樣品分析Table3 Analytical results of samples

3 結(jié)論

本試驗建立了基于離子液體的均相液液微萃取方法，并且成功地從酸奶樣品中萃取出4種磺胺類抗生素，方法簡便可行，取得了良好的效果。

1 Reynolds L，Mckee M．Factors influencing antibiotic prescribing in China：An exploratory analysis［J］．Health Policy，2009（90）：32～36．

2 Forti A F，Scortichini G．Determination of ten sulphonamides in egg by liquid chromatography–tandem mass spectrometry［J］．Analytica Chimica Acta，2009（637）：214～219．

3 M J García－Galán，M S Dáaz－Cruz，D Barceló．Combining chemical analysis and ecotoxicity to determine environmental exposure and to assess risk from sulfonamides［J］．Trends in Analytical Chemistry，2009（28）：804～819．

4 Hermo M P，Nemutlu E，Kir S，et al．Improved determination of quinolones in milk at their MRL levels using LC－UV，LCFD，LC－MS and LC－MS／MS and validation in line with regulation 2002／657／EC［J］．Analytica Chimica Acta，2008（613）：98～107．

5 Huang X J，Qiu N N，Yuan D X．Simple and sensitive monitoring of sulfonamide veterinary residues in milk by stir bar sorptive extraction based on monolithic material and high performance liquid chromatography analysis［J］．Journal of Chroatography A，2009（216）：8 240～8 245．

6 張麗媛，姚笛，何瑩，等．固相萃?。咝б合嗌V法聯(lián)用檢測花椒樣品中的玫瑰紅B［J］．黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2012（6）：53～57．

7 包錦淵，遲曉峰，董琦，等．分散均相微萃取－高效液相色譜法測定蜂蜜中的磺胺類抗生素［J］．光譜實驗室，2012，3（29）：1 934～1 937．

8 楊方，李耀平，錢疆，等．固相萃?。荻认疵摳咝б合嗌V法同時檢測飼料中十三種磺胺類藥物［J］．分析測試技術(shù)與儀器，2004，4（10）：234～237．

9 吳平谷，馮靚，王強，等．固相萃取結(jié)合高效液相色譜測定雞肉中10 種磺胺類藥物殘留［J］．中國衛(wèi)生檢疫雜志，2008，11（18）：2 201～2 203．

10 余輝菊，楊曉松，鄭萍，等．基質(zhì)固相分散－高效液相色譜法測定牛奶中的8 種磺胺類藥物殘留［J］．中國衛(wèi)生檢疫雜志，2009，1（19）：86～89．

11 段勁生，王梅，孫明娜．基質(zhì)固相分散在農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用研究進展［J］．農(nóng)藥，2006，8（45）：508～511．

12 余益軍，孫兆海，于紅霞，等．濁點萃取在環(huán)境有機分析中的影響因素及應(yīng)用［J］．理化檢驗－化學(xué)分冊，2008（44）：696～700．

13 王浩，郭啟雷，殷曉燕，等．高效液相色譜－串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜對牛奶中10種磺胺類藥物殘留的同時測定［J］．分析測試學(xué)報，2008（27）：137～139．