煙草根系分泌物的GC-MS檢測

于會泳 ，申國明， 高欣欣,2

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所/農(nóng)業(yè)部煙草生物學(xué)與加工重點實驗室，青島，266101；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京100081

煙草不宜連作已成共識，連作不但對煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生重要的不良影響[1]，也對土壤質(zhì)量產(chǎn)生重要的不良影響[2-4]?；形镔|(zhì)被認(rèn)為是造成連作障礙的重要因素，可通過影響植物生長發(fā)育的生理生化過程達到促進或損害作用。根系分泌物是化感物質(zhì)的重要來源。有關(guān)根系分泌物中化感物質(zhì)的鑒定已在其他作物有較多研究，如大蒜[5]、黃瓜[6]、辣椒[7]等，在煙草上的研究較少。王科等研究表明根系分泌物對煙草種子的發(fā)芽勢與對照相比呈極顯著差異（P＜0.01），但對萵苣和煙草種子發(fā)芽率的影響不顯著，但從外觀來看，處理的葉片比對照小[8]；郭亞利研究了烤煙品種K326根系分泌物中的堿溶性、酸溶性和中溶性三種組分對種子發(fā)芽率的影響，結(jié)果表明三種組分均對種子發(fā)芽率有抑制作用，其中酸溶性組分抑制作用最強，其次為中溶性組分，最后為堿溶性組分[9]，但中溶性組分對幼苗根系活力抑制作用最強[10]；我們研究了中煙100根系分泌物的三種組分對種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響，結(jié)果表明三種組分也均具有抑制性作用，且呈顯著性差異，對發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響大小依次為：中溶性組分＞酸溶性組分＞堿溶性組分。以上研究表明煙草根系分泌物組分因品種不同會有一定的差異，并能確定煙草根系分泌物中存在化感(自毒)物質(zhì)，但具體種類至今未有相關(guān)的研究報道。因為煙草連作障礙具有普遍性，所以具有化感作用的根系分泌物種類應(yīng)同時存在于所有品種中，基于這一思路本研究分析了NC89和K326兩個品種中共有的根系分泌物種類，初步確定了對煙草具有化感作用的根系分泌物。

1 材料與方法

1.1 供試品種

選用山東煙區(qū)兩個主栽烤煙品種NC89和K326。

1.2 實驗方法

1.2.1 幼苗砂培

實驗于2010年12月-2011年5月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院青島煙草資源與環(huán)境野外科學(xué)觀測試驗站進行。10%的鹽酸浸泡石英砂后，用水沖洗至無氯離子且pH穩(wěn)定為止，采用托盤育苗法進行常規(guī)育苗，幼苗大十字期時選擇生長一致的幼苗進行移栽。每天澆營養(yǎng)液200 mL；參試營養(yǎng)液組成如下(單位均為g/L)：Ca(NO3)2，1.90；NH4H2PO4，0.24；Mg(SO4)﹒H2O，0.98；K2SO4，1.029；CaCl2，0.894；KNO3，1.22；H3BO3，1.90；MnCl2·4H2O，1.8；ZnSO4·H2O，0.22；CuSO4·5H2O，0.08；H2MoO4·4H2O，0.09；EDTA-Fe。

1.2.2 烤煙根系分泌物的收集提取

移栽后培養(yǎng)40天，每個品種完整取出生長一致的2個植株，分別放入500 mL去離子水中培養(yǎng)（每24h更換收集一次去離子水），連續(xù)收集2d，兩天收集液混合，共2L。收集液過濾后用乙酸乙酯萃取。方法為：取定量過濾后的收集液用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相為中性組分；將剩余水相用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.0后，再用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相為酸性組分；將剩余水相再用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為8.0，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相為堿性組分，將酸性、堿性和中性乙酸乙酯萃取液分別減壓濃縮至1 mL(45℃)，過0.45μm濾膜[11]。

1.2.3 根系分泌物的硅烷化處理

將乙酸乙酯萃取后的上述濃縮樣品中分別加入0.25 mL硅烷化試劑(BSTFA:TMC=5:1)，加蓋密封后于80℃水浴中衍生2 h，待測。

1.2.4 GC-MS分析條件

硅烷化后的各組分根系分泌物采用Agilent7890A-5975C測定。采用電子轟擊源，轟擊電壓70eV，掃描范圍M/Z 30-600 amu，掃描速度0.2 s掃全程，離子源溫度230℃。毛細(xì)管柱：HP-5MS柱 (30 m × 0.25 mm,0.25 μm)，進樣口溫度250℃，柱溫50℃(2 min)，以6℃/min程序升溫至250℃(保持15 min)。載氣為He，流量1 mL/min，進樣量為1 μL。應(yīng)用NIST98質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，分析質(zhì)譜圖，確定各組分物質(zhì)名稱。

表1 K326與NC89中性提取條件下根系分泌物主要成分比較分析

續(xù)表1

2 結(jié)果

2.1 K326與NC89中性提取條件下根系分泌物主要成分比較分析

表1為K326和NC89在中性提取條件下得到根系分泌物的種類。K326和NC89共有的組分包括4-羥基丁酸、苯甲酸、丁二酸、棕櫚酸、環(huán)戊烷、二十二烷、東莨菪素、十六酰胺和硬脂酸酰胺。

K326共含有22種主要成分，其中8種有機酸，包括2-甲基乙二酸、硼酸、2-甲氧基乙二酸、4-羥基-丁酸、苯甲酸、丁二酸、肉桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸，種類數(shù)最多；酯類物質(zhì)含有5種，分別為乙酸-2苯基乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、東莨菪內(nèi)酯、己二酸二辛酯、鄰苯二甲酸二辛酯；酰胺類物質(zhì)3種，分別為十六碳酰胺、9-十八烯酰胺、硬脂酸酰胺；烷烴類物質(zhì)3種，分別為十九烷、環(huán)戊烷和環(huán)十四碳烷；根系分泌物中還包含了油酸腈和4-羥基-3-甲氧基苯乙酮。

酯類物質(zhì)所占的百分含量最高，為69.09%，其中鄰苯二甲酸二丁酯占到了48.14%，其次為乙二酸二辛酯，百分含量為19.12%；酰胺類物質(zhì)所占百分含量為8.98%；酸類物質(zhì)所占比例為7.44%，其中丁二酸含量最高，為3%，其次為棕櫚酸，為1.4%；4-羥基-3-甲氧基苯乙酮和油酸腈所占比例分別為0.52%和0.89%。

NC89移栽后40天根系分泌物中的主要成份中有機酸種類數(shù)最多，共16種，相對百分含量占8.47%；酯類物質(zhì)包含3種，分別為鄰苯二甲酸二乙酯、乙二酸二辛酯和東莨菪素，所占百分含量分別為31.17、13.07和3.02%；酰胺類物質(zhì)包括2種，分別為十六酰胺和硬脂酸酰胺；烷烴類物質(zhì)包括二十二烷和環(huán)戊烷；還包括甘油、煙堿、3－甲基－4－羥基苯甲醛、4－羥基－3甲氧基苯乙酮和油酸腈五種物質(zhì)。

表2 K326與NC89酸性提取條件下根系分泌物主要成分比較分析

續(xù)表2

續(xù)表2

2.2 K326與NC89酸性提取條件下根系分泌物主要成分比較分析

表2為K326和NC89在酸性提取條件下得到根系分泌物的種類。兩個品種共有的根系分泌物組分包括2－羥基丙酸、3－甲基－2－羥基丁酸、油酸、硬脂酸、苯甲酸、丁二酸、苯丙酸、肉桂酸、月桂酸、3－甲氧基－4－羥基苯乙酸、3，4－二羥基苯甲酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、4－羥基丁酸、鄰苯二甲酸二丁酯、己二酸二辛酯、東莨菪素、環(huán)戊烷、環(huán)十四烷、油酸腈和煙堿。

K326烤煙根系分泌物共包括43種主要物質(zhì)，所占比例總和為84.27%，主要成分為酸類物質(zhì)，共28種，所占比例為27.28%，其中棕櫚酸含量最高，為12.84%；酯類物質(zhì)5種，所占比例為47.75%，其中鄰苯二甲酸二丁酯所占比例最高，達到了33.04%；酰胺類物質(zhì)3種，所占比例為6.76%；烷烴類物質(zhì)4種，所占比例為1.23%；煙堿、4-羥基-3-甲氧基苯乙酮和油酸腈所占比例分別為0.36、0.08和0.81%。

NC89移栽后40天根系分泌物在酸性提取條件下檢測到的主要組分中有機酸種類最多，共30種，所占百分含量為17.87%；酯類物質(zhì)共包含6種，占59.34%，其中鄰苯二甲酸二丁酯為34.73%，含量最多酰胺類物質(zhì)共包括3種，分別為肉豆蔻酰胺、9-油酰胺和硬脂酸酰胺，所占比例為4.74%；烷烴類物質(zhì)包括4種，分別為環(huán)戊烷、環(huán)十四烷、2，2-雙（4-羥基）苯丙烷和十七碳烯，所占比例為0.83%；還包括甘油、油酸腈和煙堿，含量分別為0.17、0.65和0.12%。

表3 K326與NC89堿性提取條件下根系分泌物主要成分比較分析

續(xù)表3

2.3 K326與NC89堿性提取條件下根系分泌物主要成分比較分析

表3為K326和NC89在堿性提取條件下得到根系分泌物的種類。K326和NC89共有的根系分泌物包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、鄰苯二甲酸二丁酯、己二酸二辛酯和環(huán)戊烷。

在堿性提取條件下，K326主要根系分泌物所占比例為87.49%，根系分泌物種類仍以有機酸類，共11種，包括2－羥基丙酸、3－羥基丁酸、4-羥基丁酸、丁二酸、月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、順－9－十六（碳）烯酸、棕櫚酸、油酸和硬脂酸，所占比例為3.62%；酯類物質(zhì)共7種，分別為己二酸二辛酯、乙酸-2-苯基乙酯、鄰苯二甲酸二庚酯、鄰苯二甲酸單乙基己基酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二乙酯和東莨菪素，所占比例為47.17%，其中鄰苯二甲酸二丁酯所占比例為31.25%，乙二酸二辛酯為14.41%；酰胺類物質(zhì)4種，分別為三氟乙酰胺、9－油酸酰胺、硬脂酸酰胺和十六酰胺，所占比例為35.08%；烷烴類物質(zhì)包括二丁基羥基甲苯、十六烷和環(huán)戊烷，所占比例分別為0.05、0.03和0.1%；煙堿含量占0.74%；甘油和油酸腈含量分別為0.06和0.64%。

NC89移栽40天根系分泌物用堿性條件進行提取的主要種類及含量。共提取到的種類為13種，包括有機酸類、酯類、酰胺類、烷烴類和甘油，所占比例為80.93%，有機酸類包括6種，分別為硼酸、2-羥基乙二酸、棕櫚酸、月桂酸、肉豆蔻酸和硬脂酸，所占比例為3.65%；酯類物質(zhì)包括3種，分別為鄰苯二甲酸二丁酯、己二酸二辛酯和鄰苯二甲酸單（2-乙基己醇）酯，所占比例分別為51.13、19.49和3.48%；酰胺類物質(zhì)包括月桂酰胺和硬脂酸酰胺兩種，百分含量分別為1.4%和8.02%；烷烴類物質(zhì)包括環(huán)戊烷和2,2-雙（4-羥基苯）丙烷，含量分別為0.23%和0.9%；甘油含量為0.63%。

3 結(jié)論與討論

通過對K326和NC89兩個品種移栽后40天3種不同提取條件下的根系分泌物主要成分分析得出，兩個品種共有的根系分泌物包括17種有機酸，分別為2-羥基丙酸、3-甲基-2-羥基丁酸、4-羥基丁酸、苯甲酸、丁二酸、肉桂酸、3-羥基苯甲酸、4-羥基苯乙酸、月桂酸、3-甲氧基-4-羥基苯乙酸、3,4-2羥基苯甲酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、9,12-十八碳二烯酸、油酸、硬脂酸、苯丙酸；2種烷烴，分別為環(huán)戊烷和環(huán)十四烷；4種酯類：鄰苯二甲酸二辛酯、鄰苯二甲酸二丁酯、己二酸二辛酯、東莨菪素，以及硬脂酸酰胺、甘油和煙堿。甘油、苯甲酸、月桂酸、鄰苯二甲酸二丁酯、肉豆蔻酸和硬脂酸在根際土壤中也已被檢測到[17]。

由于烷烴類物質(zhì)不具有極性，丁二酸是三羧酸循環(huán)中一種有機酸，排除作為化感物質(zhì)。目前研究公認(rèn)酚酸類物質(zhì)是造成連作障礙的主要化感物質(zhì)，苯甲酸及其衍生物已在多種作物中被確認(rèn)為化感物質(zhì)，如黃瓜[6]、大豆[12]等；土壤中的對羥基苯甲酸含量隨著花生連作年限的增加而增加[13]、鄰苯二甲酸被認(rèn)為是辣椒中的主要化感物質(zhì)之一[7]；肉桂酸可抑制茄子黃萎菌孢子的萌發(fā)，當(dāng)濃度為0.5 mmol·L-1時抑制作用最大[14]，茄子與煙草同屬茄科，該結(jié)論有一定借鑒作用，肉桂酸對煙草的化感作用需進一步研究；棕櫚酸是一種重要的化感物質(zhì)[15-16]，本研究中兩個烤煙品種根系分泌物中棕櫚酸含量都較高，其作用機理有待深入研究，肉桂酸、月桂酸、肉豆蔻酸以及兩個品種共有的酯類物質(zhì)在多種作物中被證明具有化感作用。

本研究為水培條件下得到的煙草根系分泌物種類，由于土壤、尤其是根際土壤中發(fā)生著復(fù)雜的理化及生物學(xué)反應(yīng)，所以在實際生產(chǎn)中會因土壤、栽培等條件的不同而產(chǎn)生多種根系分泌物種類，水培條件下得到的根系分泌物種類這些反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究煙草根系分泌物的化感作用是下一步需要做的工作。

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