乳酸菌素研究進展及應用

權自芳，葉 泥，顏其貴，*

(1.四川農業(yè)大學動物生物技術中心，四川雅安 625014;2.四川農業(yè)大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川雅安 625014)

目前較為普遍接受的觀點為絕大多數乳酸菌在次級代謝過程中會合成一種對親緣性較近的細菌具有抑菌活性的低分子量多肽或蛋白類物質，通稱為乳酸菌素，是一類由質粒DNA編碼形成的，在細胞溶解時釋放并通過專一位點結合而對近緣相關種有致死作用的活性蛋白類物質，產生菌對其乳酸菌素具有自身免疫性［1-7］。乳酸菌素與抗生素同樣作為抑菌物質，乳酸菌素有著顯著的優(yōu)點:抗生素是某些微生物通過酶促反應將初級代謝物轉變而成，合成過程復雜，難以進行特性和結構改造，而細菌素是由基因編碼的，其生物學特性可以通過基因工程等方式進行改造;抗生素長期使用會導致菌株產生耐藥性，而細菌素敏感菌株對細菌素不會產生耐藥性［8］。目前世界上食品工業(yè)中常用的防腐劑以化學合成防腐劑居多，而化學合成防腐劑的抑菌譜有限，另外其致畸性、誘癌性以及易引起食物中毒等問題引起人們的擔憂，尋找廣譜、安全、高效、經濟的天然防腐劑成為食品領域的一個熱點，乳酸菌素作為一種無毒副作用的天然食品防腐劑以及比抗生素更具優(yōu)點的抑菌素，有著廣闊的市場前景，得到了各國科研人員的重視。

1 產生菌的選育

發(fā)酵特性優(yōu)良菌株的篩選，包括篩選的材料、方法2個方面的研究。常用的篩選材料有泡菜、新鮮牛奶、動物的腸道、糞便、發(fā)酵奶制品、發(fā)酵臘腸、生殖系統(tǒng)的分泌物等，目前已經從這些常見材料中篩選得到了大多數產細菌素的細菌［8］。傳統(tǒng)篩選法和著眼于細菌素的蛋白質或基因水平的分子篩選法，都只是篩選出自然界中原本就存在的菌株，這些出發(fā)菌株大多數存在著效價都比較低、部分生物學特性比較差，因此菌株的改良技術在改變細菌素產生菌的遺傳學特性上有著重要作用。

常規(guī)的菌株改良技術包括物理因素和化學試劑的誘變，包括紫外線(UV)、氯化鋰(LiCl)、N-亞硝基-N-乙基脲烷(NEU)、甲基磺酸乙酯(EMS)、N離子、60Co、硫酸二乙酯(DES)，以及亞硝基胍等，陳麗園等［9］(13)用紫外線誘變處理產類細菌素的乳酸乳球菌V528，類細菌素效價提高8.48倍，并具有一定遺傳穩(wěn)定性。朱文淼等［10］對抗土壤根癌農桿菌C58采用含有Cef抗生素的培養(yǎng)基進行定向競爭技術篩選和紫外誘變，得到的突變株WJK84-1的抑菌活性提高150%左右。Rollema等［11］通過基因工程得到分別含 H31K和N27K蛋白的編碼基因的2個基因改造菌株，在中性酸度條件下溶解2突變菌株所產的NisinZ，其溶解度與原始菌株所產NisinZ比較分別提高大約4倍和7倍。袁靜等［12］用含NisZ基因的質粒pHJ201為模板，采用定點突變技術將NisinZ分子中第2位Dhb突變?yōu)镈ha、B環(huán)第8位Thr突變?yōu)镾er(T8S)以及第31位His突變?yōu)長ys(T2S/H31K)以及將第31位 His突變?yōu)?Lys(N27K/H31K)和第27位Asn突變?yōu)?Lys，以 pMG36e為載體，電擊轉化乳酸乳球菌(L.lactis)NZ9800進行表達，TSS和T2S/H31K的穩(wěn)定性有明顯提高，在pH 9條件下，100℃加熱5 min仍不喪失抑菌活性。

2 乳酸菌素生物合成及影響因素

2.1 乳酸菌素生物合成

乳酸菌素是通過核糖體蛋白合成機制，在次級代謝過程中，轉錄和翻譯來合成的。乳酸菌素包括:染色體編碼，如Lactacin B、Helveticin J Nisin、Lactacin F 等;質粒編碼，如 Diplococcin、Lacticin 481、Pediocins、Sakacin A、Lac-tococcins、Lactocins等;染色體和 rDNA都參與編碼，如Camobacterocin BI。大多數革蘭陽性菌的乳酸菌素是由質?；蚓幋a的，與乳酸菌素合成相關的基因組通常還包括乳酸菌素合成基因，和編碼在轉錄調控、翻譯后修飾、加工轉運到細胞表面和菌株的自我保護性(免疫性)中發(fā)揮作用的蛋白產物的其他基因。大部分乳酸菌素是由前體肽產生的，這些前體肽有一個短的N-端前導序列(包括18～24個氨基酸)，在翻譯后的修飾中，這個部分被切除掉產生成熟的乳酸菌素［13］。細菌素產生菌在產生細菌素的同時還產生免疫蛋白，因而可以避免細菌素對自身細胞的殺傷作用［8］。

2.2 影響合成得出因素

周圍環(huán)境以及物理化學因素對乳酸菌素生物合成過程影響很大，其中最主要的是溫度和pH。

2.2.1 溫度和pH的影響 研究表明，乳酸菌素合成過程與菌株生長是密切相關的，但乳酸菌素合成的最適溫度和pH與菌株生長的最適溫度和pH并不完全一致。一般情況下，乳酸菌素的最適生產溫度和pH低于最適生長的溫度和pH，例如，對于Lactobacillus curyatus L442菌株，其生長的最適pH和溫度分別是6.0～6.5和30℃，而其生產乳酸菌素的最適pH和溫度分別是5.5和25℃。溫度對乳酸菌素的生物合成影響較大，溫度變化能明顯影響乳酸菌素的產量，卻對菌株的生長影響較小，例如，Enterococus faecium RZS C5在20℃時要比25～35℃乳酸菌素產量低，經研究表明，溫度主要通過影響信息素蛋白的生物合成來影響乳酸菌素的產量。乳酸菌素的生物合成對pH有很強的依賴性，如E.faecium RZS C5，pH恒定在7.5～8.0時，乳酸菌素的合成不受影響，當pH 在5.5～6.5時，E.faecium RZS C5不再發(fā)酵產生乳酸菌素［7］。

2.2.2 其他的影響因素 高濃度的鹽會抑制乳酸菌的生長以及乳酸菌素的合成，而中等濃度的鹽會降低乳酸菌素的合成，培養(yǎng)基成分的改變也會影響乳酸菌素的生物合成，如增加培養(yǎng)基中酵母提取物的含量能夠提高E.faecium DPC 1146的乳酸菌素的產量，而增加MRS培養(yǎng)基葡萄糖的含量會提高Lb.amylovorus DCE 471的乳酸菌素的產量［7］。

2.3 乳酸菌素活性的影響因素

乳酸菌素活性可能受多種因素的影響，如乳酸菌素的溶解度和所帶電荷的改變、食品中的蛋白酶使乳酸菌素失去活性、與其他化學物質的相互作用、乳酸菌素與食品組分的結合、環(huán)境因素的影響使靶細胞膜的結構發(fā)生改變。最近的研究表明:乳酸菌素與其他化學物質的相互作用對于乳酸菌素的活性有重要影響，例如在豬肉臘腸中，2%的乳酸鈉和Nisin結合相比于Nisin的單獨使用對抑制 S.aureus和 Sal.kentucky效果更好［7］。

3 乳酸菌的應用

3.1 在食品方面的應用

3.1.1 在乳制品中的應用 牛奶在生產、貯存和加工過程中容易受到污染。乳酸鏈球菌素已成功地用于干酪、巴氏滅菌奶、高溫處理風味奶、罐藏濃縮牛奶、高溫滅菌奶、巴氏滅菌干酪、酸奶等，它能有效抑制毒素產生和肉毒梭菌的生長，延長產品的保質期并使其可在常溫下保存。實驗證實，用少量乳酸菌素作為佐劑來生產奶油巧克力，消耗可降低80%，37℃只能保存3～7 d的產品，添加乳酸菌素后可以存放21 d，仍能保持原有風味，貨架期大幅度延長，鮮奶中加入30～50 IU/mL的乳酸菌素可以使其貨架期延長1倍［14］。

3.1.2 在肉制品中的應用 罐裝火腿、香腸、熏豬肉、咸豬肉、真空包裝的新鮮牛肉等肉制品都使用了乳酸鏈球菌素。乳酸菌素可抑制雜菌生長，乳桿菌素Sakacin能抑制單核細胞增生的李斯特菌，Nisin能很好地抑制肉毒校狀芽胞桿菌的生長。肉細菌屬某些乳酸菌所產生的乳酸菌素能抑制肉毒梭菌和革蘭陽性細菌，明串珠菌細菌素對李斯特菌、乳球菌、糞腸球菌都有抑制作用。除此之外，乳酸菌素加入肉制品中可降低pH值，較低pH值可減少殘留的亞硝酸鹽，避免對人的危害，保證肉制加工品安全［14］。

3.1.3 在啤酒及果汁飲料中的應用 Nisin可有效控制啤酒中乳酸菌和片球菌引起的腐敗，不影響啤酒的外觀和風味，且對于生長和發(fā)酵階段的啤酒酵母活率沒有影響，在低pH值、酒花物質的環(huán)境，Nisin活性不受影響，且能夠有效抑制啤酒中已發(fā)現的幾乎所有的革蘭陽性腐敗菌，提高了啤酒的生物穩(wěn)定性。此外，乳酸菌素還可以避免巴氏殺菌所帶來的“老化味”和“殺菌味”，使啤酒保持新鮮度［14］。

3.1.4 乳酸菌素在罐頭食品中的應用 乳酸菌素也使用于多種蔬菜如番茄、蘑菇、馬鈴薯、龍須菜、湯料、豌豆等罐頭中，在酸性條件下穩(wěn)定、易溶、抑菌活性高，能有效阻止抗熱微生物的生長，提高罐藏食品的營養(yǎng)價值并使其保持色澤。

3.2 乳酸菌素在醫(yī)藥方面的應用

3.2.1 抑菌作用 抑菌實驗表明，乳酸菌素對革蘭陰性細菌特別是致病的一些革蘭陽性細菌及陰性細菌，如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、單增李斯特菌、福氏志賀氏菌均有不同程度的抑制作用，故可治療腸炎、胃炎。乳酸菌素可促進胃液分泌，增強胃腸蠕動，促進食物消化［14］。吳桂榮等［15］在乳酸菌素體外抑菌實驗的研究中得出乳酸菌素對李斯特桿菌的抑菌濃度為50 mg/mL，金黃色葡萄球菌的抑菌濃度為31.25 mg/mL，對鏈球菌的抑菌濃度為31.25～50 mg/mL，對大腸埃希菌的抑菌濃度為62.5 mg/mL，對沙門氏菌的抑菌濃度為50～62.5 mg/mL。乳酸菌素經超聲波和過濾處理以后，仍然保持對不同菌種的抑菌作用，表明乳酸菌素的抑菌作用是其本身具有的一種特性，而不是依靠活菌起作用［15］。

3.2.2 改善腸道環(huán)境 乳酸菌素是多肽物質，在消化道可很快被蛋白水解酶吸收，不會影響腸道內的正常菌體存活，能選擇性殺死腸道致病菌，保護和促進有益菌的生長，調節(jié)胃腸道菌群平衡，調節(jié)腸黏膜電解質、水分平衡，改善腸道微環(huán)境［14，16］。

3.2.3 提高免疫力 微生態(tài)制劑乳酸菌素可調節(jié)免疫，增強機體的特異性與非特異性免疫，激活吞噬細胞酶的活性，選擇性殺死腸道致病菌，促進有益菌的生長，刺激腸道產生抗體，增強機體的體液免疫和細胞免疫，提高腸道免疫力［14］。

3.2.4 婦科陰道用藥 近年來發(fā)現乳酸菌素在婦科用藥方面有新的用途。含乳酸菌活菌的陰道用制劑，其代謝產物乳酸和過氧化氫等物質能保持陰道正常酸性環(huán)境。乳酸菌可直接補充陰道內正常生理菌群，調節(jié)陰道內菌群平衡，抑制或消除陰道中的有害菌的生長［14］。

3.3 乳酸菌素對肉雞血清生化指標和抗氧化功能的影響

王全溪等［17］在乳酸菌素對肉雞血清生化指標和抗氧化功能的影響實驗證實:飼糧中添加100 mg/kg乳酸菌素可顯著提高肉雞增重，降低料重比，且與飼用抗生素效果相同，飼糧中添加100 mg/kg乳酸菌素肉雞血清SOD和CAT活性及TAOC顯著提高，說明添加一定量的乳酸菌素可顯著提高肉雞抗氧化能力，且以添加100 mg/kg為最佳。陳紅梅等研究表明，在斷奶仔豬飼糧中添加0.4%乳酸菌素可極顯著提高斷奶仔豬的日增重，降低糞中大腸埃希菌數，減少腹瀉的發(fā)生。

4 小結

隨著社會經濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對健康的重視程度也日益加強，無論從食品防腐劑、保鮮劑、抑菌素還是經濟動物增肥劑發(fā)展的角度來看，純天然食品防腐、保鮮劑取代或者部分取代化學防腐劑，不產生耐藥性且可通過基因工程改造的抑菌素替代原始抗生素，無毒素殘留飼料添加劑替代原始飼料添加劑是大勢所趨。但乳酸菌素存在自身的缺點，如用量大、效價低、抗菌時效短、抗代謝性能差、抗菌譜窄等不足之處，以及優(yōu)勢菌株選育困難，菌株改造研究還有待加強，然而乳酸菌素可以采用微生物發(fā)酵的方法大量生產，同時乳酸菌素種類繁多，隨著高產乳酸菌素菌珠的選育和對乳酸菌素抑菌機理的研究深入，乳酸菌素必將得到更加廣泛的應用。

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