昆蟲(chóng)標(biāo)本DNA提取的研究進(jìn)展

胡澤章，黃 建，王竹紅

(福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州350002)

昆蟲(chóng)分子系統(tǒng)學(xué)是一門(mén)從分子角度解釋昆蟲(chóng)多樣性、系統(tǒng)發(fā)育及進(jìn)化規(guī)律(進(jìn)化歷史)的學(xué)科(黃原等，1995)。獲取有效高質(zhì)的DNA是進(jìn)行昆蟲(chóng)分子系統(tǒng)學(xué)研究的基礎(chǔ)。伴隨著PCR技術(shù)的產(chǎn)生和測(cè)序技術(shù)的不斷完善，獲取標(biāo)本DNA一維信息的技術(shù)也得到進(jìn)一步的發(fā)展(龐俊峰和張亞平，2001)，這使得從館藏標(biāo)本中提取DNA成為可能。此外，積累多年的館藏標(biāo)本，具有收藏標(biāo)本量大、種類(lèi)齊全、耗費(fèi)人力物力成本低等優(yōu)勢(shì)，特別是標(biāo)本中含有很多難以再獲得的稀有類(lèi)群，這些都將大大有利于昆蟲(chóng)分子系統(tǒng)學(xué)的研究(樸美花等，2002;杜世章和陳立僑，2004)。

中國(guó)昆蟲(chóng)標(biāo)本DNA的研究開(kāi)始于20世紀(jì)90年代，有文獻(xiàn)可查的報(bào)道最早見(jiàn)于瓢蟲(chóng)干標(biāo)本基因組DNA的提取及RAPD分析(張迎春和鄭哲民，1999)。與新鮮樣品相比，從長(zhǎng)時(shí)間保存的標(biāo)本中獲得的DNA含量極低、片段較短，而且難以進(jìn)行PCR擴(kuò)增，DNA的質(zhì)量明顯較差(龐俊峰和張亞平，2001)，為此，很多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了研究。從大量文獻(xiàn)可以看出，有關(guān)研究主要包括探討標(biāo)本不同保存方式提取DNA的優(yōu)劣(張迎春等，2002;張建珍等，2004;張晟銘等，2009)、改良不同保存方式標(biāo)本DNA提取的方法(樸美花等，2002;徐光勇等，2003)以及比較不同的DNA提取方法的優(yōu)劣(黃為等，2008;譚亮魁和王文凱，2008;喬楓等，2011;常虹等，2013)。這些研究旨在提高昆蟲(chóng)標(biāo)本DNA提取的質(zhì)量，以便更好進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)研究。

昆蟲(chóng)標(biāo)本主要分為昆蟲(chóng)干制標(biāo)本和昆蟲(chóng)浸漬標(biāo)本，不同的保存方式對(duì)于標(biāo)本DNA的影響也是不同的。所以本文根據(jù)已報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)，綜述了不同保存方式對(duì)昆蟲(chóng)標(biāo)本DNA質(zhì)量的影響，提取DNA前的預(yù)處理以及DNA的提取方法，提高DNA提取的質(zhì)量。

1 影響昆蟲(chóng)干制標(biāo)本DNA質(zhì)量的原因

昆蟲(chóng)干制標(biāo)本根據(jù)烘干方式的不同分為烘干標(biāo)本和自然陰干標(biāo)本，影響干制標(biāo)本DNA質(zhì)量的主要原因是干標(biāo)本DNA本身易降解等特性和館藏條件(徐光勇等，2003)。DNA降解的機(jī)理是:機(jī)體死亡后，細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制喪失。由于DNA的化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，可以通過(guò)水解或氧化作用自發(fā)降解(龐俊峰和張亞平，2001)，所以對(duì)于干標(biāo)本來(lái)說(shuō)，標(biāo)本保留多少DNA分子最關(guān)鍵的時(shí)期是從標(biāo)本死亡到標(biāo)本完全干燥的時(shí)間長(zhǎng)短，而與標(biāo)本的保存年代沒(méi)有相關(guān)性(龐俊峰和張亞平，2001)。張迎春等(1999)在對(duì)瓢蟲(chóng)干標(biāo)本基因組DNA的提取及RAPD分析和徐光勇等(2003)對(duì)天牛干標(biāo)本DNA的提取及RAPD-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果印證了這個(gè)觀點(diǎn)。張迎春等(2002)通過(guò)對(duì)不同儲(chǔ)存處理的4個(gè)目7種昆蟲(chóng)進(jìn)行DNA提取結(jié)果表明:烘干標(biāo)本提取的DNA質(zhì)量很好，而自然陰干標(biāo)本若環(huán)境濕度大則易霉變，提取的DNA易發(fā)生降解。外骨骼質(zhì)地堅(jiān)硬密閉的昆蟲(chóng)受到外骨骼影響，其標(biāo)本體內(nèi)水分不易蒸發(fā)，DNA降解嚴(yán)重。所以從自然陰干的昆蟲(chóng)標(biāo)本提取DNA失敗幾率很大(張晟銘等，2009)。

2 影響昆蟲(chóng)浸漬標(biāo)本DNA質(zhì)量的原因

與昆蟲(chóng)干制標(biāo)本相比，昆蟲(chóng)浸漬標(biāo)本使用固定劑對(duì)標(biāo)本進(jìn)行保存，DNA的降解率相對(duì)較低。影響昆蟲(chóng)浸漬標(biāo)本DNA質(zhì)量的主要原因在于固定劑對(duì)DNA的生理生化作用，以及固定劑成分對(duì)DNA提取試劑的影響。昆蟲(chóng)浸漬標(biāo)本經(jīng)常使用的固定劑有乙醇和福爾馬林。

乙醇作為常用的標(biāo)本固定劑，具有滲透力強(qiáng)、防腐殺菌效果好、固定速度快、抑制DNA酶活性等優(yōu)點(diǎn)(魏方超等，2012)。乙醇對(duì)標(biāo)本DNA的影響主要是造成標(biāo)本細(xì)胞內(nèi)失水、加重細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)現(xiàn)象、破壞蛋白酶K的結(jié)構(gòu)、干擾細(xì)胞的消化作用(閆晗等，2012)。很多研究表明，乙醇作為固定劑保存標(biāo)本可以滿(mǎn)足DNA提取的要求。龐虹(2001)對(duì)六斑月瓢蟲(chóng)進(jìn)行研究認(rèn)為，多年保存的酒精浸泡標(biāo)本可以作為分子系統(tǒng)學(xué)研究的材料;張迎春等(2002)通過(guò)對(duì)7種昆蟲(chóng)的不同標(biāo)本類(lèi)型進(jìn)行了基因組DNA提取比較，認(rèn)為乙醇浸泡標(biāo)本可以作為分子系統(tǒng)學(xué)研究首選的標(biāo)本類(lèi)型;張大治等(2004)對(duì)蜻蜓目昆蟲(chóng)DNA的提取方法研究認(rèn)為，從乙醇浸泡標(biāo)本中提取DNA是一種切實(shí)可行的方法;張建珍等(2004)對(duì)不同保存方式下蝗蟲(chóng)組織DNA的提取及RAPD分析中也認(rèn)為，100%乙醇標(biāo)本是RAPD的最佳標(biāo)本保存方式;張晟銘等(2009)對(duì)不同保存方式的云杉八齒小蠹總DNA提取方法的比較試驗(yàn)結(jié)果也認(rèn)為，用乙醇保存標(biāo)本效果極佳;閆華超等(2011)對(duì)蜜蜂DNA提取時(shí)認(rèn)為，75%乙醇保存蜜蜂標(biāo)本較適合于DNA的提取;鄭斯竹等(2012)通過(guò)天牛幼蟲(chóng)保存方式對(duì)DNA提取效果的研究表明，無(wú)水乙醇-20℃保存的標(biāo)本可以滿(mǎn)足后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)需要。由于乙二胺四乙酸(EDTA)可以迅速抑制DNA酶的活性，可以利用EDTA配合乙醇對(duì)標(biāo)本進(jìn)行保存。季清娥等(2006)研究了不同保存條件對(duì)繭蜂標(biāo)本基因組DNA降解的影響，認(rèn)為用含50 mmol/L的無(wú)水乙醇保存寄生蜂標(biāo)本可行。利用乙醇固定標(biāo)本需要特別注意對(duì)外骨骼堅(jiān)硬的昆蟲(chóng)進(jìn)行處理，防止乙醇被外骨骼阻礙，使得DNA降解。代金霞等(2005)對(duì)擬步甲DNA提取研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，提取DNA失敗的原因就是由此引起的。

福爾馬林(甲醛36%、甲醇8%-12%、游離酸0．02%，極少量的氯化物、硫酸鹽、重金屬和鐵)的優(yōu)點(diǎn)在于滲透力強(qiáng)、防腐殺菌效果好、固定速度快，能很好地保持生物體形態(tài)(徐來(lái)祥等，2002;閆晗等，2012)。福爾馬林對(duì)標(biāo)本DNA質(zhì)量的影響因素包括:甲醛在空氣中易氧化成甲酸，而甲酸對(duì)DNA有較強(qiáng)的降解作用(徐來(lái)祥等，2002);福爾馬林導(dǎo)致的DNA與生物分子交聯(lián)阻礙蛋白質(zhì)被蛋白酶K消化(Arrighi et al．，1968);福爾馬林溶液的pH值越低，濃度越高，對(duì)DNA的破壞越大(Douglas et al．，1998;Wiegand et al．，1996)。福爾馬林對(duì)標(biāo)本DNA擴(kuò)增也有影響，福爾馬林的化學(xué)成分都是PCR抑制劑，影響DNA擴(kuò)增效率(夏穎哲等，2006);福爾馬林使固定標(biāo)本的DNA降解成不同長(zhǎng)度的片段，不利于標(biāo)本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)(夏穎哲等，2006);同時(shí)，福爾馬林使核苷酸分子之間形成抑制DNA雙鏈變性的亞甲基，導(dǎo)致PCR反應(yīng)中止(龐俊峰和張亞平，2001)。

福爾馬林保存的組織樣品基因組DNA的破壞程度與保存時(shí)間沒(méi)有直接關(guān)系，主要與保存液是否與空氣發(fā)生氧化有關(guān)(徐來(lái)祥等，2002;閆華超等，2011)。用福爾馬林溶液保存樣品時(shí)應(yīng)當(dāng)注意密封，避免與空氣接觸。在昆蟲(chóng)領(lǐng)域，從福爾馬林固定的標(biāo)本中提取DNA進(jìn)行分析的報(bào)道很少。很多研究表明，福爾馬林作為固定劑保存標(biāo)本不利于核酸水平的分子試驗(yàn)(徐來(lái)祥等，2002;閆華超等，2011;閆晗等，2012)。

根據(jù)已有研究，為了能夠滿(mǎn)足分子系統(tǒng)學(xué)的研究，要選擇合適的標(biāo)本保存方式，減少標(biāo)本保存過(guò)程中DNA的損失，提高DNA提取的質(zhì)量。對(duì)于需要做成干標(biāo)本的昆蟲(chóng)，在制作過(guò)程中要采取合適的干制方式，盡量縮短死亡到完全干燥的時(shí)間(張建珍等，2004)。標(biāo)本制作完成后應(yīng)保存在通風(fēng)干燥的環(huán)境中。對(duì)于昆蟲(chóng)浸漬標(biāo)本，應(yīng)減少使用福爾馬林，而選擇適宜濃度的乙醇作為固定劑，并輔之EDTA，達(dá)到長(zhǎng)久保存標(biāo)本DNA的目的。

3 昆蟲(chóng)標(biāo)本DNA提取前的預(yù)處理

參考以往的大量研究，常規(guī)提取鮮活標(biāo)本DNA的方法不能很好地適用于館藏標(biāo)本，昆蟲(chóng)標(biāo)本的預(yù)處理對(duì)提高標(biāo)本DNA提取質(zhì)量影響很大(樸美花等，2002;張建珍等，2004;胡艷紅等，2006)，是提高昆蟲(chóng)標(biāo)本DNA提取質(zhì)量的關(guān)鍵。對(duì)于干制的昆蟲(chóng)標(biāo)本來(lái)說(shuō)，其預(yù)處理主要是減少外源DNA污染的可能性(主要是微生物、制作者和制作過(guò)程中的外源DNA)。一般選擇提取樣品內(nèi)部組織，其處理比較簡(jiǎn)單。樸美花等(2002)提出了一種提取膜翅目干標(biāo)本DNA的方法，提取前先把標(biāo)本放入 STE 緩沖溶液(0．1 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris·Cl pH 8．0，1 mmol/L EDTA pH 8．0)中浸漬，然后用沖洗緩沖溶液(10 mmol/L Tris·Cl pH 8．0，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2)沖洗，可以大大減少基因組DNA的機(jī)械斷裂，有利于保護(hù)干標(biāo)本基因組DNA。胡艷紅等(2006)在對(duì)天?；蚪MDNA提取方法的研究中也認(rèn)同這種處理。

昆蟲(chóng)浸漬標(biāo)本的預(yù)處理要根據(jù)不同的浸泡液來(lái)決定，通常都是以除去固定劑為目的。對(duì)于乙醇浸漬標(biāo)本來(lái)說(shuō)，起初認(rèn)為，可根據(jù)乙醇不同濃度來(lái)選擇處理方法:乙醇濃度大于75%則用蒸餾水浸泡30 min;小于75%可以直接提取(龐俊峰和張亞平，2001)。后來(lái)通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出，用0．9%NaCl溶液、PBS溶液代替蒸餾水進(jìn)行一定時(shí)間的預(yù)處理，有利于高濃度乙醇長(zhǎng)期保存標(biāo)本DNA的提取(張德華等，2004)。梁娟等(2007)通過(guò)試驗(yàn)認(rèn)為，用TE緩沖液進(jìn)行預(yù)處理，有利于高濃度乙醇長(zhǎng)期保存的標(biāo)本DNA的提取。閆晗等(2012)通過(guò)試驗(yàn)也認(rèn)為，利用緩沖液可以提高DNA的獲得率。利用緩沖液進(jìn)行預(yù)處理，有利于細(xì)胞溫和地部分恢復(fù)原來(lái)的生理環(huán)境，有利于細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)分子之間交聯(lián)的解離，為后期DNA提取創(chuàng)造條件(張德華等，2004;閆晗等，2012)。

根據(jù)龐俊峰等(2001)和夏穎哲等(2006)的研究，對(duì)福爾馬林預(yù)處理的基本方法有:利用PBS、TE、GTE等緩沖溶液降低福爾馬林的含量;用不同濃度的乙醇溶液來(lái)替換福爾馬林，從而降低福爾馬林的含量;在替換液中加入福爾馬林的結(jié)合劑(如甘氨酸(Gly));高溫加熱處理減輕福爾馬林對(duì)PCR擴(kuò)增的抑制作用;真空干燥處理降低標(biāo)本中福爾馬林的含量。因此，可以根據(jù)試驗(yàn)需要選擇一種或幾種預(yù)處理方法，提高獲得DNA的質(zhì)量。

4 昆蟲(chóng)標(biāo)本DNA提取方法

成功的核酸分離純化需要四個(gè)重要的步驟:組織或細(xì)胞的破碎和裂解，核蛋白復(fù)合體的變性，核酸酶的滅活以及污染物的去除(劉洪波等，2011)。常用于昆蟲(chóng)DNA提取的方法有以下幾種:

酚抽提法。Blin等(1976)建立的酚抽提法。該方法是利用 EDTA和十二烷基硫酸鈉(SDS)裂解細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶K處理后，用pH 8．0的三羥甲基氨基甲烷(Tris)飽和酚反復(fù)抽提DNA達(dá)到要求純度后，進(jìn)行透析或沉淀處理，獲得所需的DNA。后來(lái)發(fā)展改用酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)混合液提取純化核酸。

改良CTAB法。Murray等(1980)發(fā)明了溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)法，其機(jī)理是利用CTAB在低鹽溶液中能和核酸結(jié)合形成沉淀，在高鹽溶液中具有可分離特性來(lái)進(jìn)行DNA提取。此法開(kāi)始用于植物DNA提取，后來(lái)與其他方法結(jié)合來(lái)提取動(dòng)物基因組。Nie等(2008)發(fā)明的SDS-CTAB結(jié)合法是一個(gè)典型的代表。利用高濃度鹽離子和SDS除去蛋白和多糖，然后用低濃度鹽離子和CTAB進(jìn)一步純化DNA。改進(jìn)后的SDS-CTAB法提取的 DNA，具有純度高，無(wú)蛋白質(zhì)和RNA污染的優(yōu)點(diǎn)(張麗等，2011)。

異硫氰酸胍(GuSCN)法。Boom等(1990)發(fā)明異硫氰酸胍法。此法是利用核酸在高濃度的GuSCN條件下，能與硅顆粒結(jié)合并在較高溫度下被洗脫出的特性建立的。

堿裂解法。Birnboim等在1979年發(fā)明堿裂解法，其原理是基于堿性溶液十二烷基硫酸鈉(SDS)會(huì)使細(xì)胞壁破裂，蛋白質(zhì)和染色體DNA變性的特性。此法結(jié)合柱離心法，產(chǎn)生了現(xiàn)今常使用的DNA提取試劑盒，其特點(diǎn)是:高鹽酸性緩沖液存在時(shí)可特異性吸附DNA，除去RNA與蛋白質(zhì)等不能結(jié)合的雜質(zhì)，而低鹽堿性緩沖液可洗脫結(jié)合在吸附柱上的DNA(張麗等，2011)。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，DNA提取技術(shù)有了新的突破——核酸固相提取純化技術(shù)。與常規(guī)方法相比，在提高DNA純度方面有很大的優(yōu)勢(shì)。固相系統(tǒng)抽提核酸依賴(lài)緩沖液的pH值和鹽濃度來(lái)吸附核酸，其吸附過(guò)程基于以下原理:在離液條件下氫與親水基質(zhì)發(fā)生相互結(jié)合作用，在水溶液中則通過(guò)陰離子交換柱發(fā)生離子交換，以及通過(guò)親和力和大小排除機(jī)制(劉洪波等，2011)。此方法常用的固相基質(zhì)有二氧化硅基質(zhì)，磁珠和陰離子交換介質(zhì)。常虹等(2013)采用經(jīng)典的酚仿抽提法、改良的CTAB法、SDS法及動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒(即磁珠法)4種方法提取小蠹基因組DNA，結(jié)果在選擇的這4種提取方法中，僅磁珠法適合多年保存標(biāo)本DNA的提取。鄭斯竹等(2012)應(yīng)用磁珠法對(duì)實(shí)驗(yàn)室多年保存的天牛浸漬標(biāo)本與干標(biāo)本進(jìn)行了微量DNA提取，認(rèn)為此法完全適合多年保存標(biāo)本的微量DNA提取。磁珠法作為新興的DNA提取方法，能夠快速、高效的從血液、唾液、組織、細(xì)胞等中提取純度較高的DNA(Xin et al．，2004;Nakagawa et al．，2006)，已廣泛用于醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域(鄭斯竹等，2012)。這種新技術(shù)還需要在其他目科昆蟲(chóng)上進(jìn)行DNA提取試驗(yàn)，期待這種方法可以適用于所有標(biāo)本DNA的提取。

根據(jù)已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，雖然已有很多提取昆蟲(chóng)標(biāo)本DNA的方法，但是迄今為止還沒(méi)有一種通用的提取方法，適用于長(zhǎng)期保存的昆蟲(chóng)標(biāo)本DNA的提取。因而，不同的標(biāo)本還應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的保存狀態(tài)和不同試驗(yàn)?zāi)康?，選取不同的提取方法，才能保證研究的順利進(jìn)行。

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