供精個體和異種動物精漿對小鼠精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)染外源基因效率影響的研究

孫新明

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供精個體和異種動物精漿對小鼠精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)染外源基因效率影響的研究

孫新明

（井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西，吉安 343000）

探討供精個體和異種動物精漿對小鼠精子轉(zhuǎn)染外源DNA效率的影響，以探索精子作為外源基因的載體建立轉(zhuǎn)基因小鼠的影響因素。從性成熟小鼠的輸精管及部分附睪管中取出精子，用DIG免疫組化方法檢測和比較精子轉(zhuǎn)染效率，因素為供精個體和異種動物精漿。不同供精個體間轉(zhuǎn)染效率存在一定差異，但有的個體間差異極顯著（< 0.01），而有的個體間差異不顯著；共孵育體系中異種動物精漿可顯著降低轉(zhuǎn)染效率（實驗組與對照組分別為(8.6 ± 1.7)% vs (51.3 ± 5.3)%，< 0.01）。小鼠供精個體和異種動物精漿可影響小鼠精子轉(zhuǎn)染外源DNA的效率。

精子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染；供精個體；異種動物精漿；小鼠

精子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移(Sperm-mediated gene transfer, SMGT)是以精子為載體，在受精時將外源目的基因?qū)肼涯讣毎灾苽滢D(zhuǎn)基因動物的一種簡單而高效的方法學(xué)之一。由于其免去了顯微注射法造成的原核損傷，便于轉(zhuǎn)基因動物的研究和在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，因而是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的理想途徑。但目前該方法存在很大的隨機性和不確定性，特別是在小鼠，精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)染外源基因的效率極不穩(wěn)定[1]，極大的影響了利用精子介導(dǎo)法制備轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用與推廣。

鑒于此，本實驗就外源DNA與精子共孵育轉(zhuǎn)基因方法中供精個體與異種動物精漿對精子轉(zhuǎn)染外源基因效率的影響進行研究，以探討影響小鼠精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)染外源基因效率的因素，為利用精子介導(dǎo)法制備轉(zhuǎn)基因小鼠的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

昆明雄性8 周齡小鼠5只，山羊精漿取自農(nóng)戶飼養(yǎng)的性成熟、健康雄性本地羊。PEGFP-N1質(zhì)粒由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心饋贈，大腸桿菌由井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)生物實驗室保存。

1.1.2 主要藥品與試劑

主要試劑有肝素、卡那霉素、BSA、DMEM培養(yǎng)液均購于美國Sigma公司；DIG抗體-堿性磷酸酶復(fù)合物、DIG-dUPT末端標(biāo)記試劑盒購于Roche公司；I和III購于Takara公司；DMEM購于GIBCO公司；質(zhì)粒大量抽提試劑盒購于Omega公司；Ⅰ購自MBI公司。緩沖液Ⅰ(Tris-HCl 100 mmol/L，NaCl 150 mmol/L，pH 7.5)、緩沖液Ⅱ(Tris-HCl 100 mmol/L，NaCl 100 mmol/L，MgCl250 mmol/L,pH 9.5)、緩沖液Ⅲ(Tris-HCl 10mmol/L, EDTA 1 mmol/L, pH 8.0)和亮綠復(fù)染液（1%）均為自制。

1.2 方法

1.2.1 外源基因的準(zhǔn)備

質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、篩選（50 μg/mL卡那霉素）、擴大培養(yǎng)及質(zhì)粒抽提參考《分子克隆實驗指南》[2]和試劑盒操作說明書進行，用I和III行雙酶切鑒定，用I行單酶切獲得線性化質(zhì)粒片段，溶于TE緩沖液中，比色法測定DNA濃度并調(diào)節(jié)濃度為20 μg/m L后低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 制備精子懸浮液

將性成熟雄鼠單獨飼養(yǎng) 3 d 后，脫頸椎處死，腹部消毒，沿腹正中切開，取出附睪及輸精管，用小鑷子擠壓附睪尾部及輸精管使精子擠入預(yù)先保存于CO2培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2，濕度99%）內(nèi)的0.5 mL FM獲能液[3]培養(yǎng)瓶中，然后再放回CO2培養(yǎng)箱中，20~25 min，使精子自由浮動。

1.2.2.1 精子獲能

取10 μL上述初步孵育、分散較好的活躍精子懸浮液加入到50 μL預(yù)先保存于CO2培養(yǎng)箱的FM獲能液中置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h使精子獲能。其間吸取少量懸液用血球計數(shù)板進行計數(shù)確定精子的濃度。

1.2.2.2 精子轉(zhuǎn)染

獲能后的精子按 1μgDNA/1~3×106個精子比例加入線性化 pEGFP-N1 質(zhì)粒 DNA，輕輕混合, 置CO2培養(yǎng)箱孵育40~60 min，使精子吸附、內(nèi)化轉(zhuǎn)染外源基因。

1.2.2.3 轉(zhuǎn)染精子的后處理

所有處理樣品加入2 IU/mLⅠ后于37℃消化1 h，用4%的多聚甲醛PBS緩沖液固定20 min，用5倍FM液1500 rpm/min × 5 min洗滌3次，再混勻懸浮、涂片，備用。

1.2.2.4 轉(zhuǎn)染樣品的陽性檢測

將上述涂片進行以下處理：PBS浸洗2×5 min；緩沖液Ⅰ沖洗10 min；封閉液封閉30 min；滴加DIG單抗-堿性磷酸酶復(fù)合物(1:500~1:1000)，25℃下作用30 min；緩沖液Ⅰ洗片15 min×2；緩沖液Ⅱ平衡5~10 min，滴加顯色液(40 μL/mL NBT/BCIP)顯色1 h以上；加緩沖液Ⅲ終止反應(yīng)5 min；PBS洗片5 min×2；亮綠液復(fù)染1 h，空氣干燥，蒸餾水沖洗，鏡檢（至少數(shù)300個精子），計算陽性精子轉(zhuǎn)染效率。每個精子樣品2~3張，陽性率差異不超過10%。

1.2.3 實驗分組與設(shè)計

1.2.3.1 供精個體對轉(zhuǎn)染效率的影響

將5只性成熟并有配種能力的雄鼠，每只小鼠的獲能精液各制備3份進行轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染后檢測，比較各供精個體的精子陽性轉(zhuǎn)染率。

1.2.3.2 異種動物精漿對精子轉(zhuǎn)染效率的影響

精子獲能后懸浮液分成2份，1份加入5倍體積山羊精漿于培養(yǎng)箱條件下與外源DNA共同孵育，另一份不加異種動物精漿處理作為對照組，比較兩者間陽性轉(zhuǎn)染率，以探討異種動物精漿對轉(zhuǎn)染效率的影響。

1.2.4 統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)用SPSS for Windows(11.0)軟件中的One-way Anova進行統(tǒng)計分析，LSD方法多重比較各種因素對小鼠精子轉(zhuǎn)染效率的影響。

2 結(jié)果

2.1 供精個體對轉(zhuǎn)染效率的影響

各供精個體的精子轉(zhuǎn)染效率統(tǒng)計結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，不同供精個體間轉(zhuǎn)染效率存在差異，其中1號公鼠與其他各雄鼠間及2號公鼠與3號公鼠間差異極顯著（< 0.01），2號公鼠與4號公鼠間差異顯著（< 0.05），其他公鼠間差異不顯著（> 0.05）。

表1 供精個體對轉(zhuǎn)染效率的影響

注：同列肩注字母A與其他各字母和B與C間差異極顯著(< 0.01)， B與D間差異顯著(< 0.05)，C、D和E兩兩之間無顯著差(> 0.05)。

2.2 精子與外源DNA共孵育過程中異種動物精漿對轉(zhuǎn)染效率的影響

異種動物精漿對小鼠精子轉(zhuǎn)染效率的影響統(tǒng)計結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，異種動物精漿對小鼠精子轉(zhuǎn)染效率具有顯著影響（< 0.01）。

表2 共孵育過程中異種動物精漿對轉(zhuǎn)染效率的影響

注：同列不同肩注字母間差異極顯著（< 0.01）。

3 討論

3.1 小鼠能自發(fā)轉(zhuǎn)染外源DNA，但存在個體差異

動物精子能自發(fā)結(jié)合外源DNA已被很多研究者所證實[1,3-4]，且各種動物精子結(jié)合外源DNA的能力不一樣，其中豬和羊等動物的精子結(jié)合外源DNA的陽性率通常為25~40%，小鼠為40~60%，兔為15%~87%[4]。但精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后外源DNA分子可能存在于精子細胞膜表面，也可能被內(nèi)化進入精子內(nèi)，而一般認為外源DNA只有被內(nèi)化并與精子細胞核發(fā)生緊密聯(lián)系才有可能在受精時與合子基因組進行整合，最終產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，因此外源DNA能否進入細胞內(nèi)是關(guān)鍵。

精子結(jié)合外源DNA受多重因素影響，本實驗對簡單共孵育法轉(zhuǎn)染的小鼠精子進行免疫組化檢測時發(fā)現(xiàn)，不同動物個體的精子轉(zhuǎn)染外源基因效率存在巨大差異，與目前的同類報道一致[5]。

3.2 精漿中抑制因子對外源基因的結(jié)合抑制作用可跨越物種界限

本實驗結(jié)果表明，將去除精漿后的小鼠精子加入山羊精漿稀釋并與外源DNA共處理的轉(zhuǎn)染陽性率顯著低于對照組，說明異種動物精漿與同種動物的一樣，可強烈抑制精子轉(zhuǎn)染外源DNA。這一結(jié)果支持了Spadafora等得出的關(guān)于各種動物精漿中均存在結(jié)構(gòu)和功能相同或相似的抑制因子的結(jié)論，且該因子的結(jié)構(gòu)和功能在動物間可能存在高度保守性，可抑制外源DNA結(jié)合到精子表面DNA結(jié)合蛋白(DPB)上[6]。關(guān)于精漿的抑制作用，有研究者從哺乳動物精漿分離到能拮抗精子結(jié)合DNA的抑制因子(inhibition factor, IF-1)，該因子與外源DNA結(jié)合的部位相同，可選擇性地結(jié)合在精子核后帽區(qū)[7]。筆者對山羊精子轉(zhuǎn)染外源基因的研究中也發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果[8]。精漿中的IF-1因子抑制精子結(jié)合轉(zhuǎn)染外源DNA，對維持物種的遺傳穩(wěn)定性具有重大的意義，可以免受精子基因組被外源DNA的隨意侵入而破壞其遺傳穩(wěn)定性，是動物物種進化的必然結(jié)果[9]。

[1] Spadafora C. Sperm-mediated gene transfer: mechanisms and implications[J]. Soc Reprod Fertil Suppl,2007,65: 459-467.

[2] 薩姆布魯克, EF 弗里奇, T 曼尼啊蒂斯(美), 分子克隆實驗指南[M]. 金冬雁,黎孟楓等譯2版. 北京:科學(xué)出版社, 1996.

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[4] Gandolfi F. Sperm-mediated transgenesis [J]. Theriogenology, 2000,53(1): 127-37.

[5] 武堅, 劉明軍, 李文蓉, 等. 精子載體介導(dǎo)法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因綿羊的研究[J]. 草食家畜, 2001（增刊）: 186-190.

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The effect of sperm donor and heterogeneous seminal plasma on the efficiency of sperm transfecting exogenoius DNA by sperm-mediated gene transfer in mice

SUN Xin-ming

(School of Medicine，Jinggangshan University，Jian, Jiangxi 343009, China)

The effect of individual and heterogeneous seminal plasma on the efficiency of sperm transfecting exogenoius DNA were investigated to explore the effecting factors of sperms used as carriers of foreign gene for generating transgenic mice.The sperms were taken from the vas deferens and ductus epididymidis of mature mice, donors of sperm, seminal plasma of different types of animal as factors, and the transfection efficiency was detected and compared by DIG-labeled mono-cloned antibody.The positive transfection rates of sperms of different donors were different, but the difference was significant among some individuals (< 0.01), not among others. The transfection rates of sperm could be significantly decreased by foreign seminal plasma added in co-incubating buffer system(The transfection rates of experimental group and control group were(8.6 ± 1.7) % vs(51.3 ± 5.3) %, respectively,< 0.01).Sperm donor and heterogeneous seminal plasma can influence the efficiency of sperm transfecting exogenoius DNA in mice.

sperm-mediated gene transfer; sperm donor; heterogeneous seminal plasma; mice

1674-8085(2013)05-0090-03

S827

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2013.05.020

2013-06-16；

2013-07-22

孫新明(1968-)，男，貴州銅仁人，副教授，博士，主要從事胚胎工程和轉(zhuǎn)基因動物研究(E-mail:sunxinming2007@163.com).