骨碎補(bǔ)多指標(biāo)成分指紋圖譜控制與藥材質(zhì)量

高厚明 熊明玲 劉凱南 劉志承 劉紀(jì)青

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市中醫(yī)院藥學(xué)部，深圳518033）

骨碎補(bǔ)多指標(biāo)成分指紋圖譜控制與藥材質(zhì)量

高厚明 熊明玲 劉凱南 劉志承 劉紀(jì)青

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市中醫(yī)院藥學(xué)部，深圳518033）

目的 建立骨碎補(bǔ)藥材多指標(biāo)成分的HPLC指紋圖譜控制其藥材質(zhì)量。方法采用HPLC-DAD法色譜柱為phenomenex C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.4%冰醋酸水溶液，梯度洗脫，柱溫25℃，流速1.0ml·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。以抽皮苷、新北美圣草苷和E-4-0-β-D葡萄糖?？Х人?，3種對(duì)照品為參照物，建立骨碎補(bǔ)藥材的指紋圖譜。結(jié)果初步建立了骨碎補(bǔ)藥材的HPLC指紋圖譜，標(biāo)定8個(gè)共有峰，測(cè)定10批骨碎補(bǔ)正品中3種成分含量，抽皮苷0.56%～0.96%，新北美圣草苷0.41%～0.69%，E-4-0-β-D葡萄糖酰咖啡酸0.11%～0.36%，鑒別了真?zhèn)喂撬檠a(bǔ)。結(jié)論利用多指標(biāo)成分HPLC指紋圖譜可從定性和定量?jī)煞矫婵刂乒撬檠a(bǔ)藥材的內(nèi)在質(zhì)量，指紋圖譜的多成分評(píng)價(jià)方法優(yōu)于常規(guī)的單一指標(biāo)評(píng)價(jià)方法。

骨碎補(bǔ)；對(duì)照品；高效液相指紋圖譜；多指標(biāo)成分；鑒別

骨碎補(bǔ)為中藥材水龍骨科植物槲蕨Dryanria fortunei（Kunze）JSm的干燥根莖。其化學(xué)成分主要有黃酮類、揮發(fā)油和萜類化合物等?！吨袊?guó)藥典》［1］原來以其主要的黃酮類化合物柚皮苷（naringin）作為質(zhì)量控制的唯一指標(biāo)?，F(xiàn)代研究表明：多指標(biāo)成分分析能更全面反映中藥（如骨碎補(bǔ)等）整體質(zhì)量信息［2］。筆者以抽皮苷、新北美圣草苷及E-4-0-β-D葡萄糖酰咖啡酸多指標(biāo)成分為對(duì)照品，建立多指標(biāo)成分指紋圖譜鑒定市售骨碎補(bǔ)藥材的真假優(yōu)劣。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 HPLC儀，包括四元梯度泵，DAD紫外檢測(cè)器及Phenomenex C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱（美國(guó)Agilent公司）。

柚皮苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110722-201002），新北美圣草苷，E-4-0-β-D葡萄糖?？Х人幔ㄉ蜿?yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院提供，純度98%以上），甲醇、乙腈為色譜純，乙醇、冰醋酸、水等為分析純。10批骨碎補(bǔ)正品（詳見表1），經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院張丹雁教授鑒定為正品，廣州市藥材市場(chǎng)購(gòu)買五批骨碎補(bǔ)藥材。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：phenomenex C18（250mm× 4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）和0.4%冰醋酸水溶液（B）：二元梯度洗脫程序：0～10min，5%A～10%A，10～25min，10%A～22%A；30～40min，22%A～70%A，柱溫：25℃，流速1.0ml·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm，進(jìn)樣量：20μl。

2.2 對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取干燥恒重的抽皮苷、新北美圣草苷和E-4-0-β-D葡萄糖?？Х人徇m量，分別用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為2.52、1.096、0.520g·L-1的對(duì)照品溶液。同時(shí)另外稱取3種對(duì)照品配制成同單獨(dú)對(duì)照品溶液相同濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備精密稱取骨碎補(bǔ)藥材細(xì)粉1.0g（10批樣品分別稱定），置園底燒瓶中，分別加入30倍的50%甲醇，分別回流1h，用0.45μm微孔濾膜過濾，用50%甲醇配制成50ml備用。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 對(duì)照試驗(yàn)分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20μl，注入HPLC儀記錄40min內(nèi)的色譜峰，見圖1，高效液相色譜圖，可見骨碎補(bǔ)供試品在對(duì)照品S1、S2和S3均有相應(yīng)色譜峰。

圖1 高效液相色譜圖

2.4.2 參照物的確定骨碎補(bǔ)藥材高效液相色譜圖的三個(gè)對(duì)照品中出峰依次為S1（柚皮苷）、S2（新北美圣草苷）、S3（E-4-0-β-D葡萄糖?？Х人幔?，綜合考慮出峰時(shí)間，峰面積和分離度等因素，柚皮苷的含量最高（即峰面積最大），色譜峰分離度較好且純度高，把它作為參照物即S1，其他峰面積、出峰時(shí)間均以S1為1作參照計(jì)算。

2.4.3 精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性試驗(yàn)分別依法進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD，相對(duì)峰面積的RSD均分別在0.00%～0.57%、0.02%～2.01%（n＝6），各共有峰的相似度均分別在0.998～1（n＝6）。

2.5 各樣品中主成分含量測(cè)定

2.5.1 工作曲線的制定分別精密吸取“2.2”項(xiàng)的柚皮苷、新北美圣草苷及E-4-0-β-D葡萄糖?？Х人岬膶?duì)照品溶液適量，每一對(duì)照品均用甲醇稀釋成10ml，成為6個(gè)系統(tǒng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取樣20μl進(jìn)HPLC儀測(cè)定，分別以柚皮苷、新北美圣草苷和E-4-0-β-D葡萄糖?？Х人岬姆迕娣e為縱坐標(biāo)（y），其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，分別為YS1＝9.02× 103XS1-13.3（rs1＝0.9958），YS2＝8.19×103XS2-0.789（rs2＝0.9987），YS3＝2.60×103XS3-1.96（rs3＝0.9966）。經(jīng)總結(jié)柚皮苷、新北美圣草苷和E-4-0-β-D葡萄糖?？Х人岬馁|(zhì)量濃度分別在25.2～504mg·L-1，22.0～384mg· L-1和10.4～208mg·L-1范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

2.5.2 樣品含量測(cè)定分別精密吸取上述對(duì)照品溶液和上述10批樣品供試品溶液各20μl，分別注入HPLC儀測(cè)定其各自峰面積計(jì)算即得。見表1。

表1 10批不同來源骨碎補(bǔ)藥材中3種成分的含量（n，%）

2.6 多指標(biāo)成分指紋圖譜的構(gòu)建

2.6.1 共有指紋峰的標(biāo)定按照“常用中藥材HPLC指紋圖譜測(cè)定技術(shù)”［3］和《中藥注射劑指紋圖譜研究技術(shù)要求》，以柚皮苷為參照物（S1），分別計(jì)算10批骨碎補(bǔ)樣品指紋圖譜中各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積，詳見表2。

表2 共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積平均值及RSD（%）

因此標(biāo)定它們?yōu)楣灿兄讣y峰詳見圖2及圖1，圖中8個(gè)色譜峰為槲蕨所共有，這就作為定性定量鑒別檢測(cè)骨碎補(bǔ)的依據(jù)。

圖2 10批骨碎補(bǔ)藥材的全波長(zhǎng)HPLC二維指紋圖譜

2.6.2 共有指效峰的相似度計(jì)算評(píng)價(jià)用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”對(duì)10批骨碎補(bǔ)指紋圖譜（見圖2）進(jìn)行評(píng)價(jià)，其相似度計(jì)算結(jié)果。

10批樣品中其相似度由0.978～0.999，平均為0.988。

2.7 廣州市藥材市場(chǎng)購(gòu)買五批不同產(chǎn)地骨碎補(bǔ)的鑒別將廣州市購(gòu)買的湖南、山東、四川、廣西、山西產(chǎn)的骨碎補(bǔ)樣品各取1.0g細(xì)粉，按照“2.3”項(xiàng)方法制備供試品液，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，其指紋圖譜見圖3。

圖3 不同產(chǎn)地的市售骨碎補(bǔ)的高效液相指紋圖譜

3 討論

中藥指紋圖譜是一種用綜合、宏觀、非線性的分析觀念和質(zhì)控模式，全面表現(xiàn)中藥組成特征和質(zhì)量分析的新技術(shù)，現(xiàn)已成為國(guó)際認(rèn)同提倡并推行的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)手段［4］。本文建立了骨碎補(bǔ)中藥材3個(gè)指標(biāo)成分的HPLC指紋圖譜與文獻(xiàn)［6］指紋圖譜一致，均具有8個(gè)共有指紋峰，經(jīng)對(duì)照品比較確定8號(hào)峰為柚皮苷（S1），7號(hào)峰為新北美圣草苷（S2），2號(hào)峰為E-4-0-β-D葡萄糖?？Х人幔⊿3），其他1、3、4、5、6為其有效化學(xué)成分，具體化學(xué)物名有待進(jìn)一步確認(rèn)。

用這骨碎補(bǔ)3指標(biāo)成分的指紋圖譜鑒定廣州市藥材市場(chǎng)購(gòu)買的五批骨碎補(bǔ)，其中A（湖南）、B（山東）、C（四川）產(chǎn)的骨碎補(bǔ)指紋圖譜的共有指紋峰數(shù)不符，或其各指紋峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積無(wú)法與本研究的指紋圖譜匹配，更無(wú)法評(píng)價(jià)其相似度（見圖2、圖3），被認(rèn)定為非正品。其中D（廣西）和E（山西）產(chǎn)骨碎補(bǔ)共有指紋峰中有8個(gè)可匹配，且相似度＞0.9，這8個(gè)共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積與本法建立的指紋圖譜一致，被認(rèn)定為正品。其中D的抽皮苷含量0.71%，新北美圣草苷0.52%，E-4-0-β-D葡萄糖酰咖啡酸0.23%，即3個(gè)指標(biāo)成分含量共為1.46%，而E的S1、S2和S3分別為0.59%，0.33%和0.25%，3個(gè)指標(biāo)成分含量為1.17%，可見，廣西產(chǎn)骨碎補(bǔ)質(zhì)量比山西的優(yōu)。我國(guó)骨碎補(bǔ)正品為槲蕨（Drynariae），非正品有9種之多［5］，若不認(rèn)真鑒別選擇，將會(huì)事與愿違。

《中國(guó)藥典》前期［1］骨碎補(bǔ)中藥提取物質(zhì)量研究均以抽皮苷為唯一對(duì)照品，筆者2011年骨碎補(bǔ)HPLC指紋圖譜以柚皮苷、新北美圣草苷為雙對(duì)照品［5］，本研究增加E-4-0-β-D葡萄糖酰咖啡酸成為多指標(biāo)成分對(duì)照研究，信息更全面，圖譜更優(yōu)質(zhì)。

現(xiàn)代研究認(rèn)為：多指標(biāo)定量指紋圖譜具有數(shù)據(jù)全面、圖譜質(zhì)優(yōu)與化學(xué)計(jì)量學(xué)緊密結(jié)合等特征和優(yōu)點(diǎn)，能對(duì)中藥復(fù)雜系統(tǒng)更全面反映整體質(zhì)量，其在質(zhì)量控制領(lǐng)域中具有極好的應(yīng)用前景［2，4］。本研究中骨碎補(bǔ)8個(gè)共有峰，還有5個(gè)為未知化學(xué)成分，如若能研究知曉并提純，再作增加對(duì)照品的多指標(biāo)成分指紋圖譜的研究，像Feng C那樣把中成藥益宮膠囊（YIGONG Capsule）中的10種活性成分都分離測(cè)定，其結(jié)果將更具實(shí)用價(jià)值。看來，建立多指標(biāo)成分分析法對(duì)中藥材，中藥制劑的質(zhì)量控制其意義重大［6］。

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10.3969／j.issn.1672-2779.2013.23.116

：1672-2779（2013）-23-0158-02

蘇 玲

2013-10-11）