復(fù)方守宮散抗人胃癌裸鼠移植瘤血管生成的實(shí)驗(yàn)研究※

祝永福 夏黎明 鄭圣齊

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，合肥230031）

復(fù)方守宮散抗人胃癌裸鼠移植瘤血管生成的實(shí)驗(yàn)研究※

祝永福 夏黎明 鄭圣齊

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，合肥230031）

目的 通過研究復(fù)方守宮散對VEGF、bFGF的影響，探討其抑制血管生成的機(jī)理。方法裸鼠皮下接種人胃癌MKN-45細(xì)胞懸液，待腫瘤直徑長至0.5cm左右，隨機(jī)分組，分別給予生理鹽水、5-FU、1、2、4mg／kg／d復(fù)方守宮散進(jìn)行干預(yù)，共6周。治療前后及治療期間用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最大直徑和最小直徑，計(jì)算腫瘤體積。采用S-P免疫組織化學(xué)法檢測復(fù)方守宮散對裸鼠皮下胃癌組織中VEGF、bFGF表達(dá)的影響。結(jié)果治療前各組裸鼠腫瘤體積無明顯差異（P＞0.05）。治療結(jié)束后，復(fù)方守宮散各組及5-FU組腫瘤體積及重量小于生理鹽水組（P＜0.05），而且復(fù)方守宮散對腫瘤生長的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，5-FU的抑瘤效果強(qiáng)于中、高劑量復(fù)方守宮散（P＜0.05）。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，與生理鹽水組比較，復(fù)方守宮散和5-FU均能下調(diào)裸鼠皮下胃癌組織中VEGF、bFGF的表達(dá)（P＜0.05），并且存在劑量依賴性。復(fù)方守宮散中低劑量組VEGF表達(dá)高于5-FU組，復(fù)方守宮散各組bFGF表達(dá)亦高于5-FU組（P＜0.05）。結(jié)論復(fù)方守宮散抗血管生成的機(jī)理可能是通過抑制VEGF、bFGF的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤血管生成受到抑制。

復(fù)方守宮散；胃癌；血管生成；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子；堿性成纖維細(xì)胞生長因子

1971年Folkma首次提出腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移具有血管依賴性之后［1］，腫瘤血管生長的調(diào)節(jié)機(jī)制和抗血管生成在腫瘤治療中的意義得到廣泛關(guān)注。近年來，隨著對腫瘤血管生成機(jī)制研究的不斷深入，抗血管生成藥物也得以快速研發(fā)，其中對天然藥物及其組分的研究占有相當(dāng)大的比例。我們在既往研究的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了該課題，目的在于明確復(fù)方守宮散抗胃癌血管生成作用，闡明其作用機(jī)制，為開發(fā)具有抗腫瘤血管生成作用的中藥新藥提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品鼠抗人VEGF單抗隆抗體、鼠抗人bFGF單抗隆抗體、鼠抗人CD-34單克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司；SP超敏試劑盒、DAB購于福州邁新生物技術(shù)有限公司。另外，實(shí)驗(yàn)用藥中藥劑量確定：復(fù)方守宮散按照傳統(tǒng)煎煮法，低、中、高劑量組藥物濃度根據(jù)人與動(dòng)物體表面積與計(jì)量換算法計(jì)算［2］，低劑量組：1mg／kg／d，中劑量組：2mg／kg／d，高劑量組：4mg／kg／d，分別相當(dāng)于臨床等效劑量的1／2、1、2倍。根據(jù)5-氟脲嘧啶的LD50為117.2mg／kg，注射用量為LD50的1／3～1／5［3］，參考文獻(xiàn)選用劑量20mg／kg／d。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB／C-nu／nu裸鼠，4～6周齡，體重18～20g，雄性，在安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心無特殊病原體（Specific pathogens free，SPF）條件下分籠飼養(yǎng)，自由覓食、飲水，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立將帶有胃癌MKN-45瘤體生長良好的裸鼠以頸椎脫臼法處死，取出瘤塊置生理鹽水中切割成1.5～2.0mm 3小塊備用。將瘤塊輕推入套管針內(nèi)，左手固定裸鼠偏右側(cè)，皮膚消毒后，將帶有瘤塊的套管針刺入BALB／C-nu／nu裸鼠右側(cè)腋下皮膚，瘤塊植入皮下即可。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥裸鼠皮下瘤塊植入約一周左右即可見圓形小皮丘，待腫瘤直徑長至0.5～0.7cm（約20 d左右）時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為5組，每組3只，具體分組及給藥如下：①陰性對照組（NS組）：灌胃，生理鹽水0.2ml／d，6周；②5-氟脲嘧啶組（5-Fu組）：腹腔注射，5-Fu 20mg／kg／d，3周；③復(fù)方守宮散低劑量組（Sgs1組）：灌胃，1mg／kg／d，6周；④復(fù)方守宮散中劑量組（Sgs2組）：灌胃，2mg／kg／d，6周；⑤復(fù)方守宮散高劑量組（Sgs3組）：灌胃，4mg／kg／d，6周。實(shí)驗(yàn)過程中定期（間隔3～4天）測量腫瘤大小，并稱量裸鼠體重。

1.2.3 測定裸鼠胃癌瘤塊組織VEGF、bFGF及免疫組化圖像分析采用S-P免疫組織化學(xué)法（Immunohistochemistry，IHC）對裸鼠皮下胃癌組織中VEGF、bFGF等蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，操作方法參見說明書。陽性染色為棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞漿和（或）細(xì)胞核中，觀察染色切片中具有代表意義的高倍視野，以上述方法分析每個(gè)視野中的陽性面積和相應(yīng)OD值作為結(jié)果，免疫組化陽性表達(dá)指數(shù)＝陽性面積比×OD值。比較各組免疫組化陽性表達(dá)指數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（χ± s）表示。采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人胃癌細(xì)胞致瘤結(jié)果及荷瘤裸鼠生長情況BALB／C-nu／nu裸鼠皮下接種人胃癌MKN-45瘤塊后，所有動(dòng)物均于一周左右出現(xiàn)肉眼可見的皮下圓形小結(jié)節(jié)，大約20 d左右腫瘤直徑長至0.5～0.7cm，接種成功率為100%。經(jīng)隨機(jī)分組后，在給藥1周左右化療組部分動(dòng)物開始出現(xiàn)消瘦、活動(dòng)減少，飲食有不同程度減少的現(xiàn)象，而中藥組則在2周左右才開始出現(xiàn)類似情況，而且中藥組生長狀況明顯優(yōu)于5-Fu對照組及NS組。給藥2周左右，5-Fu對照組有裸鼠出現(xiàn)衰竭癥狀，消瘦呈弓背狀，肋骨隱約可見，活動(dòng)受限，腹部膨隆或呈蛙形腹，遂結(jié)束實(shí)驗(yàn)，犧牲所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。（見圖1）。

2.2 復(fù)方守宮散對裸鼠皮下腫瘤生長的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，治療前各組裸鼠腫瘤大小無明顯差異（P＞0.05），提示各組瘤體具有可比性。在治療過程中，生理鹽水組裸鼠腫瘤生長較快，個(gè)別腫瘤表面有破潰傾向，而復(fù)方守宮散及5-Fu組裸鼠腫瘤生長相對緩慢。治療結(jié)束后復(fù)測腫瘤大小，結(jié)果顯示，復(fù)方守宮散各組及5-Fu組腫瘤體積明顯小于生理鹽水組（P＜0.05），其中復(fù)方守宮散組隨著給藥劑量的增大其相對腫瘤增殖率逐漸減小，說明復(fù)方守宮散組抑制腫瘤生長的作用存在劑量依賴性，與5-Fu組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表1，圖2）。

表1 復(fù)方守宮散組對人胃癌MKN-45細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長的影響（χ±s，n＝3）

2.3 復(fù)方守宮散對裸鼠皮下移植瘤組織中VEGF和bFGF表達(dá)的影響將裸鼠皮下胃癌組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢查，結(jié)果顯示，復(fù)方守宮散和5-FU能夠下調(diào)胃癌組織中VEGF和bFGF的表達(dá)，與生理鹽水組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。復(fù)方守宮散各組隨著用藥劑量的增大抑制效果愈加明顯，說明存在劑量依賴關(guān)系。復(fù)方守宮散中低劑量組VEGF表達(dá)高于5-FU組（P＜0.05），而復(fù)方守宮散高劑量組的VEGF表達(dá)卻低于5-FU組（P＜0.05）。復(fù)方守宮散各組bFGF表達(dá)均高于5-FU組（P＜0.05或P＜0.01），說明5-FU下調(diào)bFGF的作用強(qiáng)于復(fù)方守宮散（表2）。

表2 復(fù)方守宮散對MKN-45細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤VEGF和bFGF表達(dá)的影響（χ±s，n＝3）

3 討論

胃癌的生長和代謝需要持續(xù)的血管生成，而且胃癌的血管新生化與其生長、浸潤、轉(zhuǎn)移、分期及預(yù)后有著密切聯(lián)系。血管生成是腫瘤生長的必要條件，直徑超過1～2mm的實(shí)體瘤的生長需要新生血管的介入和支持［4］。腫瘤的生長依賴于血管的生成，只有當(dāng)大量的腫瘤相關(guān)血管長入腫瘤實(shí)質(zhì)內(nèi)部，才能促使腫瘤持續(xù)生長和轉(zhuǎn)移；反之，腫瘤生長將受到明顯限制［5］。1996年Hanahan等［6］提出腫瘤新生血管開關(guān)學(xué)說，該學(xué)說認(rèn)為：腫瘤血管生成是諸多與血管生成有關(guān)的調(diào)節(jié)因子相互作用的結(jié)果。這些調(diào)節(jié)因子包括促血管生成因子和血管生成抑制因子，在通常情況下二者處于一定的平衡點(diǎn)，當(dāng)腫瘤由靜止?fàn)顟B(tài)發(fā)展至伴隨血管生成的浸潤狀態(tài)時(shí)，這一平衡被打破，表現(xiàn)為促進(jìn)因子的增多或／和抑制因子的減少。此時(shí)，腫瘤血管再生的開關(guān)點(diǎn)就朝向有利于血管生成的方向發(fā)展，從而啟動(dòng)了腫瘤血管再生過程，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。

VEGF和bFGF是最重要的兩個(gè)血管生成調(diào)控因子，有研究證實(shí)，VEGF參與了胃癌的形成、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，VEGF是目前所知作用最強(qiáng)的一種促血管生成因子，它具有以下生物學(xué)活性：①與特殊受體結(jié)合激活磷脂酶C，快速誘導(dǎo)鈣離子對血管內(nèi)皮細(xì)胞的直接作用，增加血管通透性，為多種細(xì)胞遷移提供一個(gè)纖維網(wǎng)架。②刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)血管構(gòu)建及生成。③參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，抑制抗原遞呈細(xì)胞成熟，促使腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視［7-10］。堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）在細(xì)胞增殖、分化、遷移和血管生成中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，與VEGF共同存在時(shí)二者具有協(xié)同作用［11，12］。

鑒于以上理論，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對裸鼠皮下移植性胃癌組織中的VEGF和bFGF進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，在胃癌組織中有VEGF和bFGF表達(dá)，而且不同劑量復(fù)方守宮散和5-氟脲嘧啶均可抑制VEGF和bFGF的蛋白表達(dá)，復(fù)方守宮散的抑制強(qiáng)度隨著藥物劑量的增大而增強(qiáng)，存在明顯量效依賴關(guān)系。提示復(fù)方守宮散對胃癌血管的生成抑制作用是通過下調(diào)血管生成促進(jìn)因子的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

通過以上研究我們認(rèn)為，復(fù)方守宮散具有明顯抑制裸鼠皮下移植性胃癌生長的作用，它對移植瘤的血管生成產(chǎn)生阻斷效應(yīng)，其作用機(jī)理可能與影響VEGF、bFGF等血管生成因子的表達(dá)，藉此抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和小管形成，最終起到抗血管生成和抑制腫瘤的作用。可見，復(fù)方守宮散具有抗血管生成和抑制腫瘤生長的作用，它在提高胃癌治療效果方面具有良好的應(yīng)用前景。

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Experimental Study on Anti-angiogenic Effects of Fufang Shougong San on the Human Gastric Carcinoma Transplanted in Nude Mice

Zhu Yongfu Xia Liming Zheng Shengqi
（Oncology Department,The First Affiliated Hospital,Anhui University of TCM,Anhui Province,Hefei,230031,China）

Objective To explore the mechanisms of antiangiogenic effects of Fufang Shougong San by studying theeffects of Fufang Shougong San on the expression of proangiogenic factors such as VEGF，bFGF．MethodsXenotransplanted models of human gastric carcinoma cell MKN-45 suspension under the dorsal skin of nude mice were established．Inoculated mice were randomly divided into normal saline（NS）group，positive control（5-fluorouracil，5-FU，20mg／kg）group，low dose Fufang Shougong San（1mg／kg）group，medium dose Fufang Shougong San（2mg／kg）group and high dose Fufang Shougong San（4mg／kg）group when the diameter of tumor was more than 0.5cm，3 in each group，and lavaged Fufang Shougong San、NS of different dosage for 6 weeks，injected 5-FU once a day for 3 weeks．All the nude mice were sacrificed after treatment，the size and weight of tumor were measured and the tumor volumes and the inhibition rates of tumor were calculated．Expression of VEGF，bFGF in subcutaneous tumors of nude mice was detected by immunohistochemical method．Results There was no significant difference in tumor volume of nude mice of different groups before treatment．The mice treated with Fufang Shougong San and 5-FU showed significantly smaller volume and weight of tumor than those of NS group（P＜0.05）after treatment，and inhibitory effects of Fufang Shougong San were in a dose-dependent manner．The volume and weight of tumor of 5-FU group were smaller than those of medium and high dose Fufang Shougong San groups（P＜0.05）．The protein expression of VEGF、bFGF of the Fufang Shougong San groups and 5-FU group were significantly lower than those of the NS group（all P＜0.05）．The protein expression of VEGF of the low and medium dose Fufang Shougong San groups was significantly higher than that of 5-FU group，and the protein expression of bFGF of 5-FU group was lower than that of the Fufang Shougong San groups（P＜0.05）．ConclusionsThe mechanism of the inhibition of angiogenesis with Fufang Shougong San treatment may be related to the downregulation of the expression of proangiogenic factors such as VEGF，bFGF．

Fufang Shougong San；Gastric carcinoma；Angiogenesis；Vascular endothelial growth factor；Basic fibroblast growth factor

10.3969／j.issn.1672-2779.2013.23.115

：1672-2779（2013）-23-0155-03

吳義紅

2013-10-21）

安徽省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目計(jì)劃［No：KJ2007A037］