靳欣欣 王 翔 毛金春 唐福州 熊延連
(重慶大學(xué)生物流變學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400044)
內(nèi) 毒 素 (endotoxin, ET ) 即 脂 多 糖(lipopolysaccharides,LPS)。人體在嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染時(shí)易引發(fā)內(nèi)毒素血癥(Endotoxemia,ETM),進(jìn)而引起全身炎癥反應(yīng)綜合征、膿毒癥、多器官功能障礙綜合征等。
利用血液凈化方法[1]去除體內(nèi)內(nèi)毒素是現(xiàn)在臨床研究重點(diǎn),其根本是尋找一種高效安全的凈化吸附材料。
內(nèi)毒素的吸附原理是利用了內(nèi)毒素分子的負(fù)電性、疏水親水性及含有大量可形成氫鍵的-OH,吸附作用包括了靜電作用、氫鍵作用、疏水作用[2]:靜電作用去除內(nèi)毒素主要是利用了內(nèi)毒素在pH 值大于1.3 時(shí)帶負(fù)電的特性。正電性分子如-NH2可吸附內(nèi)毒素。在3 種吸附作用中,靜電吸附相對(duì)而言是吸附率最高的。但缺點(diǎn)是因血液中的蛋白多為負(fù)電性,所以共吸附現(xiàn)象嚴(yán)重,選擇性不高。
氫鍵吸附利用了材料分子上所帶的可以與內(nèi)毒素形成氫鍵作用的官能團(tuán),如-COOH、-OH等。氫鍵吸附是三種吸附中作用力最弱的,但如果在-NH2的β 位上存在-OH,此時(shí)的氫鍵作用可大大強(qiáng)化-NH2的靜電吸附作用,這是因?yàn)棣?位形成的氫鍵在分子構(gòu)型中可與內(nèi)毒素分子形成穩(wěn)定的八元環(huán)[3]。
疏水吸附利用的是材料分子上有疏水作用的官能團(tuán),基于了內(nèi)毒素分子具有親水、疏水的雙相性。疏水作用在三種吸附作用中的作用力居中,但其吸附選擇性要優(yōu)于靜電作用。
血液凈化吸附內(nèi)毒素材料通常都是通過(guò)大分子樹脂等直接連接配基或者引入間隔臂連接配基。配基材料的選用是決定吸附材料性質(zhì)最關(guān)鍵的因素,Mitzner 等將聚乙烯亞胺(PEI)固定于纖維素球載體,吸附內(nèi)毒素效果明顯[4];將純化的血清白蛋白共價(jià)交聯(lián)在聚甲基丙烯酸酯上,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可通過(guò)靜電作用吸附內(nèi)毒素、TNF、IL-6 等[5];多粘菌素B是唯一有抗內(nèi)毒素作用的抗生素[6],特異性強(qiáng)、吸附效率高,但其具有腎毒性和神經(jīng)毒性,使用受到限制[7-8]。
應(yīng)用氨基酸作為內(nèi)毒素吸附材料的研究,方暉[9]等人曾采用球形纖維素連接多種氨基酸,從而研究了其不同的吸附效率,徐堃[10]、韋俊華[11]則研究了以PVDF 基膜連接不同氨基酸的內(nèi)毒素吸附材料。
近年來(lái)用血液凈化法治療內(nèi)毒素血癥取得了一定的進(jìn)展,在水溶液中很多吸附材料都可以達(dá)到相當(dāng)高的吸附率(約為90%)[9-11],但是血漿中的吸附率以及材料的血液相容性、安全無(wú)毒性等都有待提高。
綜合考慮以上因素,本課題選擇了對(duì)人體安全無(wú)害的肝素連接苯丙氨酸制成吸附材料。該材料兼具了安全無(wú)毒性和良好的血液相容性,同時(shí)依據(jù)肝素的氫鍵吸附和苯丙氨酸的疏水吸附來(lái)保持較高的血漿中的內(nèi)毒素吸附率。
本課題研究的內(nèi)毒素吸附材料,是采用氨基化后的氯球作為基底材料,之后連接肝素作為連接臂,再連接苯丙氨酸,利用了肝素上-NH2的β 位羥基可形成分子內(nèi)氫鍵以及苯丙氨酸的疏水性來(lái)進(jìn)行內(nèi)毒素吸附。
選用氯甲基樹脂,俗稱氯球(ps)是吸附劑常用的載體材料,特點(diǎn)是力學(xué)性能適宜、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、易吸附疏水性物質(zhì),其官能團(tuán)氯甲基可作為偶聯(lián)其他連接臂或者直接連接配基的活性基團(tuán),有利于進(jìn)行樹脂表面的改性。
肝素(heparin)是一種天然生物活性多糖類的化合物,具有抗凝血性,在體內(nèi)體外都有抗凝血作用,同時(shí)生物相容性良好,這也是本課題采用肝素作為連接臂的主要考量之一。
肝素連接有較多化學(xué)活性官能團(tuán),利于與不同配基的連接。雖然在人體內(nèi)生理環(huán)境下帶負(fù)電荷,但具有可以形成氫鍵的官能團(tuán)-COOH、-OH,此外正電性基團(tuán)-NH2具有β 位羥基,會(huì)加強(qiáng)其靜電吸附的作用,這些特性都增強(qiáng)了吸附內(nèi)毒素的能力;而作為臨床上常用的凝血?jiǎng)?,肝素可以減少材料對(duì)血液中蛋白的吸附,同時(shí)提高了對(duì)內(nèi)毒素的特異性吸附。圖1 為肝素的分子結(jié)構(gòu)圖。
圖1 肝素分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The heparin molecular structure diagram
血液凈化過(guò)程中,為避免凝血,管路都需進(jìn)行肝素化涂層,而直接利用肝素作為吸附材料的組成之一,這也有利于透析過(guò)程中的抗凝血。
配基的選擇,考慮到氨基酸對(duì)人體的安全性以及良好的血液相容性,以及此前有很多相關(guān)機(jī)理的研究,因此認(rèn)為肝素分子臂連接氨基酸是較為適宜和有發(fā)展前景的一種吸附材料。20 種氨基酸中,因?yàn)殪o電吸附選擇性不高且連接臂肝素為負(fù)電性會(huì)互相抵消吸附效果,所以沒有選擇正電性的堿性氨基酸;氫鍵吸附作用力弱,未選擇含有兩個(gè)-COOH的酸性氨基酸;從中性氨基酸中選擇疏水性比較強(qiáng)的芳香族氨基酸——苯丙氨酸,其特點(diǎn)是非極性氨基酸,等電點(diǎn)為5.48。其他芳香族氨基酸有:酪氨酸屬于極性氨基酸(無(wú)疏水性)且等電點(diǎn)(5.68)與苯丙氨酸接近;色氨酸雖然同樣屬于非極性氨基酸,等電點(diǎn)(5.89)也與苯丙氨酸接近,但是從立體構(gòu)象上而言,對(duì)稱性不強(qiáng)。圖2 為苯丙氨酸和色氨酸的球棍模型圖。
圖3 為肝素分子連接苯丙氨酸的預(yù)想結(jié)構(gòu)模型圖。本研究希望達(dá)到的效果是:肝素含有大量重復(fù)基團(tuán)氨基和羧基,苯丙氨酸通過(guò)羧氨縮合反應(yīng)與肝素大分子鏈相連,其苯環(huán)垂直于肝素分子鏈,構(gòu)成如右圖所示的類似樹干(圖中涂黑底色外較深色分子,即肝素分子鏈)與樹杈的結(jié)構(gòu)。同時(shí)這種樹型結(jié)構(gòu)通過(guò)肝素與載體樹脂的共價(jià)縮合而包裹在樹脂球表面,吸附過(guò)程中在血漿中擾動(dòng)進(jìn)而通過(guò)疏水和氫鍵的雙重作用吸附內(nèi)毒素分子。這也是沒有選擇其他非芳香族疏水性氨基酸的原因。
圖2 苯丙氨酸(左)、色氨酸(右)球棍模型Fig. 2 Phenylalanine (left ),Tryptophan (right)stick model diagram
圖3 肝素分子鏈連接苯丙氨酸預(yù)想模型Fig. 3 The expected model of heparin molecular chain connection phenylalanine
氯甲基樹脂(天津南開合成科技有限公司,中國(guó))、肝素鈉(重慶百萃生物科技有限公司,中國(guó))、L-苯丙氨酸(成都市科龍化工試劑廠,中國(guó))、甲苯胺藍(lán)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,中國(guó))、EDC(Sigma 公司,美國(guó))、NHS(Sigma 公司,美國(guó))、內(nèi)毒素/顯色基質(zhì)鱟試劑盒(廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司,中國(guó)),所有試劑均為分析純。傅里葉變換紅外光譜儀(Spectrum GX,Perkin Elmer 公司,美國(guó))、紫外-可見分光光度計(jì)(TU-1901,北京普析通用儀器設(shè)備有限責(zé)任公司,中國(guó))、倒置熒光顯微鏡(IX71,OLYMPUS 公司,日本)、恒流泵(HL-2,上海青浦滬西儀器廠,中國(guó))、血液細(xì)胞分析儀(BC-2000,深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司,中國(guó))、全自動(dòng)血液生化分析儀(BS-200,深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司,中國(guó))。
5 g 氯球(ps)在1,4-二氧六環(huán)溶液中溶脹2 h后轉(zhuǎn)移至250 mL 三口燒瓶中;5.0 g NaOH、0.2 g 四丁基溴化銨溶于40 mL 蒸餾水加入反應(yīng)體系;向反應(yīng)體系中加入50 mL 乙二胺,反應(yīng)混合物于85 ℃攪拌反應(yīng)6 h,得到氨基化氯球(ps-NH2):
用Na2HPO4和檸檬酸配制檸檬酸緩沖液,用NaOH 調(diào)節(jié)pH 至4.7(EDC 最佳活性條件),加入催化劑EDC 與NHS(摩爾比值為1∶1);配制一定濃度肝素檸檬酸緩沖液,0.5 g 的ps-NH2浸入肝素溶液中,37 ℃恒溫振蕩反應(yīng)數(shù)小時(shí),得到肝素化氯球(ps-hep)。
圖4 為EDC/NHS 催化羧氨縮合反應(yīng)的機(jī)理[12]。EDC 通過(guò)與-COOH 反應(yīng)形成O-?;惲螂逯虚g體,然而,該中間體在水溶液中很不穩(wěn)定,易于水解。O-酰基異硫脲中間體在NHS 存在的情況下,可以轉(zhuǎn)變?yōu)?NH2反應(yīng)活性的NHS-活性酯,這種NHS-活性酯中間體非常穩(wěn)定,可以允許將縮合反應(yīng)分解成兩步進(jìn)行。
在肝素連接苯丙氨酸的反應(yīng)中,肝素和苯丙氨酸都存在-NH2與-COOH,-NH2是正電性基團(tuán),利用靜電作用吸附內(nèi)毒素,而-COOH是負(fù)電性基團(tuán),利用氫鍵吸附內(nèi)毒素,而這兩種吸附作用靜電吸附作用力更強(qiáng),因此希望苯丙氨酸盡量使用-COOH與肝素的-NH2反應(yīng),進(jìn)而保留自身的-NH2。
所以這一步中催化劑的使用有所不同,具體步驟為:用Na2HPO4和檸檬酸配制檸檬酸緩沖液,用NaOH 調(diào)節(jié)pH,加入催化劑EDC 活化一定質(zhì)量的苯丙氨酸0.5 h(目的是提高苯丙氨酸中-COOH的活化比例),再加入EDC/NHS(摩爾比值為1∶1)及含有2.5 g ps-hep 的檸檬酸緩沖液,37 ℃恒溫振蕩反應(yīng)數(shù)小時(shí),得到肝素-苯丙氨酸吸附材料(hep-Phe)。
圖4 EDC/NHS 催化酰胺反應(yīng)原理Fig. 4 The mechanism of catalyzing acid amid condensation reaction by EDC/NHS
將制備好的ps-NH2真空干燥24 h 后,采用紅外光譜法對(duì)其進(jìn)行分析鑒定,觀察氯球經(jīng)乙二胺活化前后所發(fā)生的變化。
試管中加入10 mg 的ps-NH2,5 mL 0.2% 的NaCl 溶液,1 mL 0.005% 的甲苯胺藍(lán)溶液,混合均勻,于恒溫振蕩箱37 ℃反應(yīng)2 h。取樣品試管上層液體2 mL,加入分液漏斗中,然后各加入2 mL 正己烷,劇烈振蕩,萃取一定時(shí)間后在紫外分光光度計(jì)631 nm 處測(cè)其吸光度,并比照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算肝素固定量。通過(guò)改變肝素初始濃度和反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)來(lái)尋找最佳反應(yīng)條件。
小心收集肝素連接苯丙氨酸反應(yīng)后的洗脫液,因?yàn)楦嗡胤肿咏Y(jié)構(gòu)中不含苯環(huán),所以對(duì)測(cè)定影響不大。故可于254 nm[13]下測(cè)定洗脫液的紫外吸收,利用差量法計(jì)算苯丙氨酸的固定量。
將0.2 g 的ps-NH2、ps-hep 以 及hep-Phe 在 含有50 μg/mL FITC-LPS 的兔子血漿溶液中分別進(jìn)行了吸附實(shí)驗(yàn),吸附反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為2 h,通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察表面熒光強(qiáng)度來(lái)定性觀察吸附情況。
鱟試劑顯色基質(zhì)法用于內(nèi)毒素的定量檢測(cè),基本原理為細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑中C 因子進(jìn)行酶促反應(yīng),產(chǎn)生凝固酶,其可將人工合成的顯色基質(zhì)分解為黃色的對(duì)硝基苯胺(PNA)和多肽。PNA 可進(jìn)一步被偶氮試劑染成玫瑰色,在545 nm 下測(cè)量反應(yīng)液中的吸光度值而進(jìn)行內(nèi)毒素定量。
吸附實(shí)驗(yàn)中,將0.5 g 的吸附材料填充入2 mL的注射器中,兩頭用脫脂棉塞住,連接恒流泵和燒杯自制成血液灌流裝置進(jìn)行血漿灌流動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)。
利用鱟試劑盒檢測(cè)hep-Phe 吸附材料分別與不同內(nèi)毒素初始濃度的水溶液及兔子血漿溶液反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)2 h 后的吸附量,確定內(nèi)毒素初始濃度對(duì)吸附的影響。之后利用鱟試劑盒檢測(cè)相同內(nèi)毒素初始濃度下經(jīng)過(guò)不同反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)后兔子血漿溶液中內(nèi)毒素的吸附量,繪制吸附曲線。
用一次性注射器自制血液灌流器,裝入0.5 g hep-Phe 吸附劑,灌流前使用肝素鈉生理鹽水沖管3次,控制適當(dāng)流速,進(jìn)行離體血液灌流實(shí)驗(yàn)。吸附2 h 后,分別取20 μL 與2 mL 于血液細(xì)胞分析儀和常規(guī)全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血細(xì)胞及血液生化指標(biāo)變化。
圖5 為氯甲基樹脂氨基化前后的的紅外光譜。虛線表示氨基化反應(yīng)之前,實(shí)線表示氨基化反應(yīng)之后。圖中可以看到:氨基化反應(yīng)之前,苯環(huán)上C-H的伸縮振動(dòng)峰、苯環(huán)骨架振動(dòng)、苯環(huán)CH、CH2面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰,以及氯甲基CH2Cl 的幾個(gè)特征峰,即CH2面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰,4 位被CH2Cl 取代1,4-二取代苯=C-H 面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰(1 265 cm-1),以及C-Cl 伸縮振動(dòng)峰。
圖5 ps 和ps-NH2 的紅外檢測(cè)圖Fig.5 The FTIR Spectra of chloromethyl ps
氨基化反應(yīng)之后,主要特征峰未出現(xiàn)明顯變化,但3 300 ~3 377 cm-1之間則出現(xiàn)了氨基-NH2的伸縮振動(dòng)峰,而1 265 cm-1處的峰則沒有了,此峰表征了氯甲基強(qiáng)化的= C-H 的面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰,說(shuō)明乙二胺與苯環(huán)上的氯甲基發(fā)生了反應(yīng),將-NH2成功引入到了氯甲基樹脂上。
圖6 是肝素初始反應(yīng)濃度對(duì)肝素固定量的影響。固定反應(yīng)時(shí)間為24 h,濃度大于5 mg/mL時(shí),其固定量基本達(dá)到飽和。
圖6 肝素濃度對(duì)肝素固定量的影響Fig.6 The influence of the heparin concentration on the fixed amount of heparin
圖7 是反應(yīng)時(shí)間對(duì)肝素固定量的影響。選用5 mg/mL 的肝素與吸附劑反應(yīng)不同時(shí)間的肝素含量進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)時(shí)間大于24 h 后其固定量基本達(dá)到穩(wěn)定飽和。
圖7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)肝素固定量的影響Fig.7 The influence of the lasting time on the fixed amount of heparin
圖8 是苯丙氨酸初始濃度對(duì)苯丙氨酸固定量的影響。pH 值保持4.7,反應(yīng)時(shí)間控制在24 h。苯丙氨酸固定量在濃度大于5 mg/mL 時(shí),處于較高且穩(wěn)定的水平,基本達(dá)到飽和。
圖8 苯丙氨酸初始濃度對(duì)固定量的影響Fig.8 The influence of the Phe concentration on the fixed amount of Phe
圖9 是反應(yīng)時(shí)間對(duì)苯丙氨酸固定量的影響??刂票奖彼岢跏紳舛葹? mg/mL,反應(yīng)體系pH 值為4.7,當(dāng)時(shí)長(zhǎng)大于24 h 后固定量也基本不變,達(dá)到飽和。
圖9 反應(yīng)時(shí)間對(duì)固定量的影響Fig.9 The influence of the lasting time on the fixed amount of Phe
圖10 是體系pH 值對(duì)苯丙氨酸固定量的影響。苯丙氨酸初始濃度為5 mg/mL,反應(yīng)時(shí)間為24 h,則體系最適pH 值應(yīng)為4.7。
圖10 pH 對(duì)固定量的影響Fig. 10 The influence of the pH on the fixed amount of Phe
圖11 是兔子血漿溶液中吸附熒光標(biāo)記內(nèi)毒素的效果圖。圖中可以明顯的看到,熒光內(nèi)毒素均勻的包裹在吸附材料外層,且連接有苯丙氨酸的吸附材料效果也明顯優(yōu)于肝素化氯球和氨基化氯球的吸附。
圖11 兔子血漿溶液中吸附熒光標(biāo)記內(nèi)毒素效果ps-NH2(a),ps-hep(b),hep-Phe(c)Fig. 11 Adsorption FITC-LPS effect diagram in rabbit plasma solution:ps-NH2 (a ),ps-hep (b ),hep-Phe (c )
圖12 和圖13 是不同內(nèi)毒素初始濃度下內(nèi)毒素的吸附量和吸附率。圖12 可以看出,反應(yīng)2 h 后材料在水中和血漿中的吸附量隨著內(nèi)毒素初始濃度的增加而增加,但是圖13 表明吸附率的變化并不大;在水中的吸附率保持在79%左右而在血漿中吸附率約為68%,最高可達(dá)到72%。
圖12 內(nèi)毒素初始濃度對(duì)吸附量的影響Fig.12 The influence of the initial concentration of the LPS adsorption amount
圖13 內(nèi)毒素初始濃度對(duì)吸附率的影響Fig.13 The influence of the initial concentration of the LPS adsorption rate
圖14 為反應(yīng)時(shí)間與內(nèi)毒素吸附量的影響。是內(nèi)毒素初始濃度為0.5 EU/mL,吸附時(shí)間2 h 之內(nèi)的血漿溶液內(nèi)毒素吸附量曲線圖:由圖14 中可以看出,吸附材料在0.5 h 處就已達(dá)到最大吸附量的90%以上的吸附率,并且在1 h 左右達(dá)到了吸附平衡。
圖14 血漿中吸附時(shí)間對(duì)內(nèi)毒素吸附量的影響Fig. 14 The influence of the lasting time on LPS adsorption amount
表1 為經(jīng)體外模擬灌流后血液成分的變化。灌流2 h 后,血液成分變化不大,血細(xì)胞相對(duì)變化率都在5%以下,血漿蛋白的相對(duì)變化率則在10%以下,即血漿蛋白能夠有90%以上的回收率,其中血小板前后變化率在5%以下,在臨床可接受范圍內(nèi)。
表1 灌流材料對(duì)血液成分的影響Tab.1 The material affect on the blood component
材料的合成分為三部分:
第一步將基底材料氯球氨基化,合成氨基化氯球ps-NH2,合成結(jié)果利用紅外檢測(cè);
第二步利用EDC/NHS 作為催化劑進(jìn)行羧氨縮合反應(yīng),將肝素連接到ps-NH2上合成肝素化氯球ps-hep,經(jīng)甲苯胺藍(lán)法檢測(cè)結(jié)果為:選用5 mg/mL 作為肝素反應(yīng)初始濃度,并且最適反應(yīng)時(shí)間控制在24 h,可以達(dá)到肝素分子在材料表面的最佳固定量,從而使肝素分子盡可能發(fā)揮其結(jié)構(gòu)的空間效應(yīng)及生物活性,從而改善材料的生物相容性,為進(jìn)一步固定氨基酸減少更多的空間位阻;
第三步仍然利用EDC/NHS 作為催化劑進(jìn)行羧氨縮合反應(yīng),考慮到其催化機(jī)理,先用EDC 活化反應(yīng)過(guò)程中提供-COOH 的苯丙氨酸,之后再加入EDC/NHS 與ps-hep,得到肝素連接苯丙氨酸吸附材料hep-Phe。利用紫外吸收法檢測(cè)結(jié)果為:苯丙氨酸連接內(nèi)毒素的實(shí)驗(yàn)條件選擇為苯丙氨酸初始濃度5 mg/mL,反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)24 h,體系pH 值4.7 可以達(dá)到最大固定量。推測(cè)此pH 值是由于——反應(yīng)催化劑EDC 的最適反應(yīng)條件為4.7 ~6.0,而苯丙氨酸等電點(diǎn)為5.48,在低于等電點(diǎn)的pH 溶液中,苯丙氨酸發(fā)生堿式解離,其自身-COOH 更易發(fā)生羧氨縮合形成酰胺。
通過(guò)hep-Phe 對(duì)FITC-LPS 的吸附結(jié)果可以定性的得出結(jié)論:熒光內(nèi)毒素均勻的包裹在吸附材料外層,且連接有苯丙氨酸的吸附材料效果也明顯優(yōu)于肝素化氯球和氨基化氯球的吸附,說(shuō)明苯丙氨酸作為配基的引入可以大大提高肝素對(duì)內(nèi)毒素的吸附效果。
通過(guò)自制灌流器對(duì)兔子血漿的吸附,材料在水中和血漿中的吸附量隨著內(nèi)毒素初始濃度的增加而增加,但是吸附率變化并不大;在水中的吸附率保持在79%左右,而在血漿中吸附率約為68%,最高可達(dá)到72%。這是因?yàn)檠獫{中存在的血漿蛋白與內(nèi)毒素在材料表面存在的吸附競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。對(duì)于內(nèi)毒素的吸附效應(yīng),因?yàn)檠獫{蛋白與內(nèi)毒素都帶有大量負(fù)電荷,故疏水吸附比靜電吸附對(duì)于內(nèi)毒素的選擇性要更強(qiáng)一些。相比其他研究中的一些吸附材料[9-11],雖然在水中的吸附率沒有達(dá)到90%的較高水準(zhǔn),但在血漿中吸附率達(dá)到了72%,相比水中吸附率78% 下降較少,對(duì)內(nèi)毒素的吸附選擇性更優(yōu)異。
臨床上要求血漿與吸附材料的接觸時(shí)間介于2~6 h 之內(nèi),因而血液凈化材料能否在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到吸附平衡至關(guān)重要,而通過(guò)不同吸附時(shí)間下測(cè)得的吸附量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出吸附材料在0.5 h 處就已達(dá)到最大吸附量的90%以上的吸附率,并且在1 h 左右達(dá)到了吸附平衡,具有一定的臨床使用價(jià)值。
理想的血液灌流吸附劑除了要有較高的吸附量外,還需要具有吸附特異性及良好的生物相容性,要達(dá)到特異選擇吸附致病物質(zhì),同時(shí)對(duì)其他血液成分的非特異吸附較少的效果。
本課題所選用的基底材料氯甲基樹脂是常用的載體材料,血液相容性比較理想,而連接臂肝素為臨床用血液抗凝劑,所用配基氨基酸是存在于人體的組成蛋白質(zhì)的基本分子。理論上而言相容性良好,為了驗(yàn)證該結(jié)論,進(jìn)行了血液相容性試驗(yàn),得出結(jié)論材料對(duì)血液成分的影響較小,在可接受范圍之內(nèi),在目前研究中的各種內(nèi)毒素吸附材料中結(jié)果比較理想。
本課題選用氯甲基樹脂作為基底材料,肝素作為分子壁,苯丙氨酸作為配基,對(duì)水和兔子血漿分別進(jìn)行了體外模擬血液灌流實(shí)驗(yàn)吸附內(nèi)毒素,在水中的吸附率保持在79%左右,在血漿中吸附率約為68%,最高可達(dá)到72%。同時(shí)對(duì)材料的血液相容性進(jìn)行了測(cè)定,血液成分變化不大,血細(xì)胞相對(duì)變化率都在5%以下,血漿蛋白的相對(duì)變化率則在10%以下,即血漿蛋白能夠有90% 以上的回收率,其中血小板前后變化率在5% 以下,在臨床可接受范圍內(nèi)。
材料的吸附效率和血液相容性都較好,有一定的臨床應(yīng)用前景。
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