臭氧和負(fù)離子對(duì)鐮刀菌M4抑制作用及其機(jī)理的初步研究

臭氧和負(fù)離子對(duì)鐮刀菌M4抑制作用及其機(jī)理的初步研究

李慧1，黃思1，RASULOV FARRUHBEK2，齊小保1，嚴(yán)守雷1，王清章1，李潔1
（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢，430070；2.Tashkent Chemical Technological Institute）

為了探究臭氧和負(fù)離子對(duì)蓮藕采后主要腐敗菌-鐮刀菌M4的生長(zhǎng)及細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的影響，本試驗(yàn)對(duì)處于穩(wěn)定期的鐮刀菌M4分別進(jìn)行不同條件的臭氧和負(fù)離子處理，通過測(cè)定抑菌率、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜通透性初步研究臭氧和負(fù)離子對(duì)鐮刀菌M4的抑制作用及其機(jī)理。結(jié)果顯示，臭氧、負(fù)離子對(duì)鐮刀菌M4均有較強(qiáng)的抑制作用,抑菌率與處理時(shí)間成正相關(guān)；臭氧和負(fù)離子之間具有協(xié)同作用；臭氧+負(fù)離子處理對(duì)鐮刀菌M4的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜均有顯著的破壞作用，破壞程度隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；處理前期主要是電解質(zhì)的滲出，處理2 h及以上時(shí)核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)開始滲出。

鐮刀菌M4；臭氧；負(fù)離子；抑菌率；細(xì)胞壁；細(xì)胞膜；通透性

臭氧在常溫下是一種不穩(wěn)定的淡藍(lán)色氣體，有特殊的刺激味。由于臭氧的強(qiáng)氧化性和廣譜性，因而具有消毒、殺菌、除臭、防霉、保鮮等功能[4]，其殺菌能力僅次于氟，是氯的3倍，殺菌速度極快，是氯的500～3 000倍[5]。一般認(rèn)為，臭氧殺滅細(xì)菌、霉菌類微生物是通過作用于細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜構(gòu)成受到損害，導(dǎo)致新陳代謝障礙并抑制其生長(zhǎng)，進(jìn)而繼續(xù)滲透破壞膜內(nèi)組織，直至細(xì)胞死亡[6]。又由于臭氧使用方便、刺激性小、作用快速、無(wú)殘留污染等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品保鮮與加工等領(lǐng)域[7]。

負(fù)離子是帶負(fù)電的原子或基團(tuán)[6]。氣體放電過程中產(chǎn)生的負(fù)離子具有較高的活性，且有很強(qiáng)的氧化還原作用，能破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜或細(xì)胞原生質(zhì)活性酶的活性，在果蔬保鮮中可以起到抗菌殺菌的目的[8]。同時(shí)，負(fù)離子還可以分解內(nèi)源乙烯，鈍化酶活性，降低呼吸強(qiáng)度，從而減緩營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在貯藏期間的轉(zhuǎn)化。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)臭氧和負(fù)離子的研究多集中于應(yīng)用保鮮方面，對(duì)其抑菌機(jī)理報(bào)道較少。本試驗(yàn)通過測(cè)定抑菌率、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜通透性變化，對(duì)臭氧、負(fù)離子抑制鐮刀菌M4的作用及其機(jī)理做了初步探究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

②試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 （PDA）由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

③儀器設(shè)備 MIC-03臭氧變送器由深圳市藍(lán)月測(cè)控技術(shù)有限公司生產(chǎn)；XA-1負(fù)離子發(fā)生器、DDS-11A電導(dǎo)率儀由上海雷磁儀器廠生產(chǎn)；722N分光光度計(jì)由上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；J-E超速冷凍離心機(jī)由美國(guó)Beckman Coulter Inc生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

①抑菌率的測(cè)定 將鐮刀菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d后，在菌落邊緣打出直徑6 mm的菌餅，移至PDA平板中央，然后將打開蓋子的平板立即放入密閉有機(jī)玻璃箱中進(jìn)行以下處理 （溫度25℃，濕度50%）：A.臭氧（3 500 mg/m3）、B.負(fù)離子（106ions/cm3）、C.臭氧+負(fù)離子（臭氧3 500 mg/m3+106ions/cm3），分別處理1，2，3，4 h。每個(gè)處理重復(fù)3皿，置于25℃下培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測(cè)定其菌落擴(kuò)展直徑，并計(jì)算抑菌率。以不做任何處理的培養(yǎng)基為對(duì)照。用抑菌率表示其對(duì)鐮刀菌M4的抑制效果。

抑菌率（%）=[（對(duì)照菌落的平均直徑-處理菌落的平均直徑）/對(duì)照菌落的平均直徑]×100%

②對(duì)菌體細(xì)胞壁的影響 選取C處理的菌餅于PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取培養(yǎng)3 d后的菌液，同時(shí)不做處理的作為對(duì)照組，4℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液用分光光度計(jì)于510 nm處測(cè)定吸光值[9]。

③對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的影響a.對(duì)電導(dǎo)率的影響。選取C處理的菌餅于PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取培養(yǎng)3 d后的菌液，同時(shí)以不做處理組作為對(duì)照，4℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液用電導(dǎo)率儀測(cè)定電導(dǎo)率，確定金屬離子的滲出變化趨勢(shì)[10]。

b.對(duì)大分子內(nèi)含物滲出的影響。選取C處理的菌餅于PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取培養(yǎng)3 d后的菌液，同時(shí)以不做處理組作為對(duì)照，置于超速冷凍離心機(jī)中4℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液分別于260 nm和280 nm處測(cè)定吸光值[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理?xiàng)l件對(duì)鐮刀菌的抑制作用

從圖1可知，在臭氧 （3 500 mg/m3）、負(fù)離子（106ions/cm3）、臭氧+負(fù)離子（臭氧3 500 mg/m3+ 106ions/cm3）3種不同處理?xiàng)l件下，抑菌率與處理時(shí)間均呈正相關(guān)，處理時(shí)間越長(zhǎng)，抑菌效果越好；且臭氧+負(fù)離子處理的抑菌效果均優(yōu)于臭氧、負(fù)離子單獨(dú)處理，說(shuō)明臭氧和負(fù)離子處理之間具有協(xié)同作用，這對(duì)于提高鐮刀菌生長(zhǎng)抑制率具有重要意義。方差分析顯示，同一處理時(shí)間，3種處理間差異極顯著（＜0.01），每種處理中不同處理時(shí)間差異極顯著（＜0.01）。

2.2 臭氧+負(fù)離子對(duì)菌體細(xì)胞壁通透性的影響

堿性磷酸酶位于細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的間隙之中，在正常情況下不向外分泌，只有當(dāng)細(xì)胞壁的通透性增大后，堿性磷酸酶才會(huì)釋放到細(xì)胞體外[10]。由圖2結(jié)合顯著性分析可知，處理組與對(duì)照組相比，堿性磷酸酶的溶出量顯著增加（＜0.05），且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，兩兩之間均有顯著差異（＜0.05）。由此說(shuō)明，臭氧+負(fù)離子處理對(duì)細(xì)胞壁的破壞作用顯著，導(dǎo)致其通透性顯著變化，且處理的時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞壁的破壞效果越顯著。

2.3 臭氧+負(fù)離子處理對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響

①臭氧+負(fù)離子處理對(duì)電導(dǎo)率的影響 由圖3可知，處理組鐮刀菌M4培養(yǎng)液的電導(dǎo)率顯著高于對(duì)照組（＜0.05），且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，電導(dǎo)率增大，兩兩之間具有顯著差異（＜0.05），說(shuō)明臭氧+負(fù)離子處理的菌體細(xì)胞隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，電解質(zhì)的滲出量不斷增大，細(xì)胞膜被破壞。

圖1 不同處理?xiàng)l件下的抑菌率

圖2 臭氧+負(fù)離子處理對(duì)菌體細(xì)胞壁通透性的影響

圖3 臭氧+負(fù)離子處理對(duì)電導(dǎo)率的影響

②臭氧+負(fù)離子處理對(duì)大分子內(nèi)含物滲出的影響 細(xì)胞膜的通透性是反映細(xì)胞膜完整性的一部分，當(dāng)真菌細(xì)胞膜被破壞后，細(xì)胞內(nèi)的小分子物質(zhì)首先外泄出來(lái)，接著是大分子物質(zhì)如核酸和蛋白質(zhì)[2]。為進(jìn)一步反映臭氧+負(fù)離子處理對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響，可以測(cè)定滲透到細(xì)胞外的核酸和蛋白質(zhì)的含量。核酸、蛋白質(zhì)分別在260 nm、280 nm處有最大吸收峰，對(duì)260 nm和280 nm吸收物質(zhì)的檢測(cè)被廣泛應(yīng)用于測(cè)定細(xì)胞膜的完整性[12]。

由圖4結(jié)合顯著性分析可知，與對(duì)照組相比，臭氧+負(fù)離子處理1 h，細(xì)胞外液核酸和蛋白質(zhì)的含量沒有顯著變化（＞0.05）；臭氧+負(fù)離子處理2 h及以上組細(xì)胞外液核酸和蛋白質(zhì)的含量顯著增加（＜0.05），且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光值數(shù)值增大，處理2 h及以上組細(xì)胞外液核酸和蛋白質(zhì)的含量隨時(shí)間延長(zhǎng)均有顯著差異（＜0.05），尤其在處理3 h后差異顯著增大。由此說(shuō)明，臭氧+負(fù)離子處理逐步導(dǎo)致鐮刀菌M4大分子內(nèi)含物滲出，且隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，這種效應(yīng)逐漸增大。

綜合圖3和4分析可知，臭氧+負(fù)離子處理對(duì)鐮刀菌M4的細(xì)胞膜有顯著的破壞作用，破壞程度隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，處理前1 h主要導(dǎo)致小分子電解質(zhì)滲出，致使細(xì)胞外液電導(dǎo)率顯著增加，當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)至2 h及以上時(shí)，核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)才透過細(xì)胞膜，滲透到菌體外，處理3 h后核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)開始快速滲出。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)初步研究了臭氧、負(fù)離子對(duì)鐮刀菌M4的抑菌作用及其機(jī)理，結(jié)果表明臭氧、負(fù)離子對(duì)蓮藕采后病原菌鐮刀菌M4均有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌率與處理時(shí)間呈正相關(guān)；臭氧和負(fù)離子之間具有協(xié)同作用；臭氧+負(fù)離子處理對(duì)鐮刀菌M4的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜均有顯著的破壞作用，破壞程度隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；處理前期主要是電解質(zhì)的滲出，處理2 h及以上時(shí)核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)開始滲出?？赡苷浅粞?負(fù)離子處理對(duì)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的這種逐步破壞，導(dǎo)致其通透性增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流，影響菌體新陳代謝和生命活動(dòng)，從而達(dá)到對(duì)鐮刀菌M4的抑制效果。

圖4 臭氧+負(fù)離子處理對(duì)核酸（A）和蛋白質(zhì)（B）滲出的影響

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Inhibition Effects and Mechanism of Ozone and Anion on Fusarium M4

LI Hui1,HUANG Si1,RASULOV FARRUHBEK2,QI Xiaobao1, YAN Shoulei1,WANG Qingzhang1,LI Jie1

We determined the inhibition rate and permeability of cytoderm and cytomembrane of Fusarium M4 with different densities of ozone and gas-phase anion,to study the inhibition effects and mechanism of ozone and anion on Fusarium M4 which caused rhizome rot of lotus root.The results showed that,both the ozone treatment and the gas-phase anion treatment had stronger inhibitory effects on Fusarium M4,and the inhibition rates were positively correlated with processing time. Ozone and gas-phase anion had a synergistic effect on inhibiting Fusarium M4,and the treatment ozone+gas-phase anion damaged the cytoderm and cytomembrane of Fusarium M4 dramatically,moreover the damage aggravated as the processing time prolonged.The electrolyte mainly leaked at earlier stage,and macromolecules such as nucleic acids and proteins began to leak after being treated by two hours.

Fusarium M4;Ozone;Anion;Inhibition rate;Cytoderm;Cytomembrane;Permeability

S182

：A

：1001-3547（2013）18-0098-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2013.18.031

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助（項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)2011JC024）

李慧（1989-），女，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏加工質(zhì)量與安全

李潔（1976-），女，通信作者，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工質(zhì)量與安全，電話:18071090408，E-mail:lijie1976@mail.hzau.edu.cn

2013-07-30