不同種培養(yǎng)基對(duì)體外誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的生物活性及細(xì)胞毒作用

王志爽，李新靈，邵曉楓，任 峰

（1.天津斯坦姆再生醫(yī)學(xué)技術(shù)研究開發(fā)中心，天津300384；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，天津300020）

關(guān)于腫瘤的治療傳統(tǒng)方法如外科手術(shù)、放療、化療常常無(wú)法完全清除轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤細(xì)胞。過(guò)繼細(xì)胞免疫治療是治療腫瘤的一種重要方法，作用原理主要是取出腫瘤患者體內(nèi)部分有潛力的免疫細(xì)胞，由多種免疫因子刺激誘導(dǎo)，經(jīng)過(guò)體外的干預(yù)，擴(kuò)增其數(shù)量，激活和強(qiáng)化其功能，并教會(huì)它們?nèi)绾巫R(shí)別機(jī)體內(nèi)的異常細(xì)胞，如惡性腫瘤細(xì)胞或者病毒感染細(xì)胞，然后再回輸?shù)交颊咦约后w內(nèi)。其殺傷機(jī)制表現(xiàn)為直接殺傷作用和免疫效應(yīng)細(xì)胞參與的間接殺傷作用。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-induced killer,CIK）是將人血單個(gè)核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子[如抗CD3單克隆抗體（CD3M cAb）、IL-2、IFN-γ等]共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞群。其兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性和自然殺傷（NK）細(xì)胞的非主要組織相容性復(fù)合體（MHC）限制性殺瘤特點(diǎn)[1-2]。培養(yǎng)基作為細(xì)胞培養(yǎng)中的主要載體，對(duì)誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞的各種生物活性指標(biāo)起到至關(guān)重要的作用，對(duì)于免疫治療的推廣應(yīng)用有重要作用。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者通過(guò)運(yùn)用多種培養(yǎng)基，比較培養(yǎng)出的細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞在體外增殖能力、殺傷活性、免疫表型變化及分泌細(xì)胞因子水平，旨在為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 CD3McAb、IL-2、IFN-γ、MD-CMSTM-N培養(yǎng)基、細(xì)胞處理試劑盒均為天津美德太平洋科技有限公司產(chǎn)品，AIM-V培養(yǎng)基為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，RPMI 1640培養(yǎng)基為TaKaRa公司產(chǎn)品，MTT（噻唑鹽）為Sigma公司產(chǎn)品，F(xiàn)ITC標(biāo)記的小鼠抗人CD3，PE標(biāo)記的小鼠抗人CD8、CD56及相應(yīng)的同型對(duì)照購(gòu)于美國(guó)BD公司。檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ的ELISA試劑盒均購(gòu)自上海滬宇生物科技有限公司。

1.2 靶細(xì)胞來(lái)源 BJAB為人B淋巴瘤細(xì)胞株，K562為人紅白血病細(xì)胞，均引自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所。

1.3 方法

1.3.1 CIK細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增 采集健康人外周血，將采好血液離心2300r/min 8min，上層血漿吸出轉(zhuǎn)入另一離心管中，此血漿放置水浴鍋中56℃，30min滅活，1800r/min離心8min，將處理好的上清轉(zhuǎn)入另一離心管中放置4℃?zhèn)溆?。用?xì)胞處理試劑盒分得單個(gè)核細(xì)胞，分別用RPMI 1640、MD-CM-STM-N和AIM-V在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，每組細(xì)胞數(shù)為2×107。每組40mL培養(yǎng)基內(nèi)含CD3McAb 5μg/mL，IFN-γ 1000U/mL，rhIL-21000U/mL，5%自體血清，置于飽和濕度、37℃、5.0%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3天添加新鮮培養(yǎng)液，補(bǔ)充CD3McAb、IFN-γ、rhIL-2用量同前，此后每3d添加新鮮培養(yǎng)基，補(bǔ)加IFN-γ用量相同，IL-2用量減半。

1.3.2 細(xì)胞增殖能力測(cè)定 在細(xì)胞培養(yǎng)的第0、4、7、10、13和15天分別用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)所培養(yǎng)的細(xì)胞，并在鏡下觀察形態(tài)。

1.3.3 細(xì)胞免疫表型分析 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)（Beckman-coulter EPICS-XL）CIK細(xì)胞的免疫表型，分別在第0、6、10和15天收集5×106細(xì)胞。

1.3.4 細(xì)胞毒活性檢測(cè) 以不同效靶比5∶1、10∶1、20∶1、40∶1的比例放入96孔板，另設(shè)單獨(dú)靶細(xì)胞及效應(yīng)細(xì)胞孔，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，置37℃、5.0%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，按文獻(xiàn)[3]的MTT法測(cè)殺傷活性。

殺傷活性（%）=[靶細(xì)胞OD值-（效應(yīng)細(xì)胞OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）]/靶細(xì)胞OD值×100%

1.3.5 細(xì)胞因子的測(cè)定 分別取培養(yǎng)第0、4、9、13、 16天的CIK細(xì)胞以1×106/mL接種于24孔板中，充分洗滌后收集上清，用ELISA雙抗夾心法，按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)培養(yǎng)上清中的IFN-γ的分泌水平。

2 結(jié)果

2.1 增殖能力比較 實(shí)驗(yàn)表明，在培養(yǎng)第0天單個(gè)核細(xì)胞光鏡下呈圓形，大小均勻，前3天3組均無(wú)明顯形態(tài)變化，數(shù)量無(wú)明顯變化可能有微量減少。到第4～7天進(jìn)入生長(zhǎng)期，并有集落出現(xiàn)，但RPMI 1640組集落相對(duì)較少，3種培養(yǎng)條件下增長(zhǎng)趨勢(shì)無(wú)明顯區(qū)別，第10～13天達(dá)到生長(zhǎng)高峰，RPMI1640增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯不如其余兩組。最終，由2×107個(gè)細(xì)胞，RPMI1640組增殖1.6×109；MD-CM-STM-N組增殖至2.2×109；AIM-V組增殖至1.8×109。MD-CMSTM-N擴(kuò)增倍數(shù)為（108.75±9.04）倍，AIM-V擴(kuò)增倍數(shù)為（91±5.96）倍，RPMI 1640擴(kuò)增倍數(shù)（78±3.14）倍，3組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖1）。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間與增殖倍數(shù)關(guān)系(%，±s)Fig 1 Relationship between cultured time and proliferation multiple(%，±s)

2.2 細(xì)胞免疫表型的分析 比較3種培養(yǎng)條件下檢測(cè)CD3+、CD8+、CD3+CD56+這3種CIK細(xì)胞重要表型指標(biāo)表達(dá)情況，結(jié)果表明隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，CD3+CD8+及CD3+CD56+雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例兩種無(wú)血清培養(yǎng)基優(yōu)勢(shì)明顯高于RPMI 1640組（P<0.05，表1～3）。而且AIM-V表現(xiàn)出前期表達(dá)效率高的特點(diǎn)，而MD-CM-STM-N則在最終表達(dá)效率較高。

表1 3種培養(yǎng)基CD3細(xì)胞表型比較(±s,%,n=3)Tab 1 The CD3cell phenotypes in 3different culture mediums (±s,%,n=3)

表1 3種培養(yǎng)基CD3細(xì)胞表型比較(±s,%,n=3)Tab 1 The CD3cell phenotypes in 3different culture mediums (±s,%,n=3)

與RPMI 1640組值相比，*P<0.05

時(shí)間CD3+ D0D6D15RPMI164055.26±3.2282.70±3.1291.52±4.73MD-CM-STM-N 55.26±3.2289.51±2.10* 98.52±3.56* AIM-V 55.26±3.2293.01±3.22* 96.18±1.67*

表2 3種培養(yǎng)基CD8細(xì)胞表型的比較(±s,%,n=3)Tab 2 The CD8cell phenotypes in 3different culture mediums (±s,%,n=3)

表2 3種培養(yǎng)基CD8細(xì)胞表型的比較(±s,%,n=3)Tab 2 The CD8cell phenotypes in 3different culture mediums (±s,%,n=3)

與RPMI 1640組值相比，*P<0.05

時(shí)間D0D6D15RPMI164021.27±4.3138.36±4.2452.28±5.12CD3+CD8+ MD-CM-STM-N 21.27±4.3138.92±2.3270.22±3.98* AIM-V 21.27±4.3143.87±4.0661.81±2.55*

2.3 殺傷活性 將3組細(xì)胞分別作為效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)BJAB及K562在不同效靶比下進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明3組細(xì)胞均有殺傷活性，并且隨著效靶比的提高殺傷效率也隨之增強(qiáng)，但相同效靶比下細(xì)胞毒性強(qiáng)度不同，MD-CM-STM-N和AIM-V組直接無(wú)顯著差距但均高于RPMI1640組，尤其在高效靶比下差距明顯（表4）。

表3 3種培養(yǎng)基CD56細(xì)胞表型比較(±s,%,n=3)Tab 3 The CD56cell phenotypes in 3different culture mediums (±s,%,n=3)

表3 3種培養(yǎng)基CD56細(xì)胞表型比較(±s,%,n=3)Tab 3 The CD56cell phenotypes in 3different culture mediums (±s,%,n=3)

與RPMI 1640組值相比，*P<0.05，**P<0.01

時(shí)間D0D6D15RPMI16401.92±1.015.72±1.5511.27±2.01CD3+CD56+ MD-CM-STM-N 1.92±1.019.58±2.3721.52±3.32** AIM-V 1.92±1.0112.81±1.58* 25.60±2.18**

表4 3種培養(yǎng)基對(duì)瘤細(xì)胞殺傷活性(±s,%,n=3)Tab 4 Killing activities on tumour cells by 3different culture mediums（±s,%,n=3)

表4 3種培養(yǎng)基對(duì)瘤細(xì)胞殺傷活性(±s,%,n=3)Tab 4 Killing activities on tumour cells by 3different culture mediums（±s,%,n=3)

與RPMI 1640組值相比，*P<0.05

BJAB E/T 5:110∶120∶140∶1RPMI 164013.12±2.1221.3±1.2133.86±2.0352.70±2.18MD-CM-STM-N 19.11±3.1232.76±0.9640.28±2.33* 61.25±5.16* AIM-V 21.12±4.1428.13±2.3139.97±2.7857.96±2.23RPMI 164010.16±1.9515.28±3.6027.61±4.0140.12±2.01K562MD-CM-STM-N 14.17±2.2120.38±3.1334.81±3.14* 53.2±2.78* AIM-V 16.19±3.1523.60±2.6134.92±2.08* 52.56±3.13*

2.4 細(xì)胞分泌IFN-γ能力測(cè)定 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞均分泌IFN-γ，第4天RPMI 1640組達(dá)到分泌最高峰，其余兩組也接近最高值略低于RPMI 1640組，但MD-CM-STM-N和AIM-V培養(yǎng)細(xì)胞分泌因子有相對(duì)穩(wěn)定的高強(qiáng)度分泌時(shí)期（圖2）。

圖2 3 種培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞IFN-γ分泌比較Fig 2 IFN-γ secretion of cells in 3different culture mediums

3 討論

CIK細(xì)胞過(guò)繼免疫治療腫瘤，克服了以往效應(yīng)細(xì)胞增殖數(shù)量少，需輸注IL-2，低效及副作用大等的不足，現(xiàn)已成為腫瘤生物治療的重要分支，它對(duì)于促進(jìn)患者免疫系統(tǒng)的重建、骨髓凈化、微小殘留病灶的清除以及防止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等均具有重要的意義[4]。而作為免疫細(xì)胞體外增殖誘導(dǎo)的重要載體即為培養(yǎng)基，它直接關(guān)系著體外誘導(dǎo)結(jié)果，包括增殖數(shù)量、殺瘤效果等等，因?yàn)閭鹘y(tǒng)培養(yǎng)基添加大量異體血清存在安全隱患，無(wú)血清培養(yǎng)基由于其所需血清大幅降低，在血源性細(xì)胞的培養(yǎng)中自身血樣中提取的小量血清即可滿足，甚至可以無(wú)需添加而被廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)在無(wú)血清培養(yǎng)基已用于血源性細(xì)胞的培養(yǎng)、真核系統(tǒng)中重組蛋白的表達(dá)、病毒及寄生蟲的繁殖等各個(gè)方面[5-9]。

無(wú)血清培養(yǎng)基MD-CM-STM-N和AIM-V是可用于臨床試驗(yàn)的體外誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的產(chǎn)品。本實(shí)驗(yàn)中，筆者主要通過(guò)幾項(xiàng)重要指標(biāo)測(cè)試其對(duì)體外增殖誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的支持能力，是關(guān)于免疫治療的重要基礎(chǔ)條件。

CIK細(xì)胞是在多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)條件存在下，從外周血、骨髓或臍血中分離出單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)而獲得的一種免疫活性細(xì)胞。其兼有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性與NK細(xì)胞的非主要組織相容性復(fù)合物（MHC）限制性殺瘤特點(diǎn)[10]，CD3、CD56能夠共同表達(dá)，因此此項(xiàng)免疫表型檢測(cè)也是探討依據(jù)。本文從細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞免疫表型表達(dá)水平，對(duì)瘤細(xì)胞殺傷效果以及IFN-γ分泌能力等方面比較了無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的支持作用，為MD-CM-STM-N培養(yǎng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，MD-CM-STM-N和AIM-V培養(yǎng)細(xì)胞的增殖速度高于RPMI 1640培養(yǎng)基，并且增殖高峰期平臺(tái)得到延長(zhǎng)，RPMI 1640組快速增長(zhǎng)期在9～11d，而其余兩組在9～14d一直處于快速增殖水平，從最終增殖數(shù)目看MD-CM-STM-N更為理想，這說(shuō)明AIM-V增殖能力較強(qiáng)并且穩(wěn)定，而MD-CM-STM-N增殖能力最強(qiáng)也同樣穩(wěn)定。

免疫表型的結(jié)果可以看出在CIK細(xì)胞重要表型指標(biāo)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞的表達(dá)，MD-CM-STM-N和AIM-V培養(yǎng)細(xì)胞也表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)，強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間均好于RPMI 1640對(duì)照組，MD-CM-STM-N在此項(xiàng)指標(biāo)中結(jié)果顯示最優(yōu)。由于前面提到CIK是兼具NK細(xì)胞特點(diǎn)的淋巴細(xì)胞，所以CD3+、CD56+的表達(dá)也是重要的指標(biāo)，在此項(xiàng)檢測(cè)中MD-CMSTM-N和AIM-V培養(yǎng)細(xì)胞也表現(xiàn)出了優(yōu)于RPMI 1640組的結(jié)果，但這一表型結(jié)果中AIM-V最好，可見MD-CM-STM-N更趨向T細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)，而AIM-V則較多體現(xiàn)在NK細(xì)胞上的繁育特點(diǎn)。

目前CIK細(xì)胞的抗腫瘤作用機(jī)制還未完全明了，但普遍認(rèn)為CIK細(xì)胞可被淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原有關(guān)識(shí)別結(jié)構(gòu)激活，導(dǎo)致胞漿毒性顆粒釋放和BLT酯酶產(chǎn)生而殺傷腫瘤細(xì)胞;因表面CD3受體結(jié)合而激活，導(dǎo)致胞漿毒性顆粒釋放而產(chǎn)生溶瘤作用;可產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制或殺傷；CIK細(xì)胞也可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[11]。

本實(shí)驗(yàn)所用兩種瘤細(xì)胞對(duì)殺瘤效果做了基礎(chǔ)探討，RPMI 1640殺傷效果不如另外兩組，而MDCM-STM-N和AIM-V在不同靶細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出差異，具體定向殺傷機(jī)制尚未完全明確。3種培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的IFN-γ分泌水平也有差異，這一指標(biāo)可以代表細(xì)胞活化程度，MD-CM-STM-N和AIM-V組無(wú)明顯差異，但表現(xiàn)出優(yōu)于RPMI 1640組的分泌穩(wěn)定性，說(shuō)明更利于維持細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間活性。

由于無(wú)血清培養(yǎng)基增殖誘導(dǎo)活化功能，表現(xiàn)出更強(qiáng)更穩(wěn)定水平，成分明確安全，對(duì)于臨床的追溯性更強(qiáng)，因此在免疫細(xì)胞治療中有著長(zhǎng)遠(yuǎn)優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景，本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示國(guó)內(nèi)無(wú)血清培養(yǎng)基更適于生物治療研究。

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