對(duì)氯甲基苯甲酸鏈接的萊克多巴胺人工抗原的合成與鑒定

陳 臣，羅順菁,*，劉成梅，鄒常春，汪志宇，王文飛

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)資產(chǎn)管理處，江西 南昌 330031)

對(duì)氯甲基苯甲酸鏈接的萊克多巴胺人工抗原的合成與鑒定

陳 臣1，羅順菁1,*，劉成梅1，鄒常春2，汪志宇1，王文飛1

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)資產(chǎn)管理處，江西 南昌 330031)

采用對(duì)氯甲基苯甲酸(CBA)為鏈接臂，用混合酸酐法將萊克多巴胺(RAC)與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)制備人工抗原(RAC-CBA-BSA)，通過(guò)紫外、紅外、電泳鑒定抗原合成成功；再以卵清蛋白(OVA)為載體蛋白合成包被抗原(RAC-CBA-OVA)，測(cè)定其與抗體的親和力和抑制率。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果以對(duì)CBA為鏈接臂合成的包被抗原對(duì)應(yīng)的抗體滴度為7047.3、IC50為17.05ng/mL，結(jié)果表明，CBA可以用于RAC人工抗原的合成，使用RAC-CBA-OVA作為包被抗原可以提高ELISA檢測(cè)靈敏度。

萊克多巴胺；對(duì)氯甲基苯甲酸；ELISA靈敏度；人工抗原

萊克多巴胺(RAC)具有營(yíng)養(yǎng)重分配，降低胴體脂肪，提高瘦肉率，同時(shí)使動(dòng)物增重的作用[1-2]。但是人類(lèi)過(guò)量食用(超過(guò)1.25μg/(kggd))含有該殘留的畜產(chǎn)品會(huì)引發(fā)食物中毒，表現(xiàn)為惡心、嘔吐、心悸、頭疼、目眩等[3-4]，對(duì)患有高血壓、青光眼、糖尿病等疾病的患者則可能危及生命。RAC在中國(guó)被禁止使用于飼料添加，是中國(guó)食品安全委員當(dāng)前發(fā)布的第一批82種禁止在飼料、動(dòng)物飲用水和畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中使用的藥物和物質(zhì)之一。在體育比賽中，RAC可以增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)員、動(dòng)物(如馬)肌肉，提高運(yùn)動(dòng)成績(jī)，國(guó)際奧委會(huì)已將其列為禁用藥物。

目前對(duì)于RAC的檢測(cè)方法主要有氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)[5-6]、高效液相色譜(HPLC)[7]以及液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)[8-9]等方法，這些方法準(zhǔn)確、科學(xué)，但對(duì)操作者的專(zhuān)業(yè)要求較，儀器昂貴，且維護(hù)費(fèi)用較高，不利于推廣應(yīng)用。酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法(ELISA)是一種基于抗原抗體反應(yīng)和酶化學(xué)反應(yīng)的快速檢測(cè)方法，靈敏度高、特異性強(qiáng)、樣品前處理簡(jiǎn)單，不需要昂貴的儀器設(shè)備，對(duì)操作人員的專(zhuān)業(yè)要求相對(duì)較低，非常適于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大批量篩選。

RAC人工抗原是研制酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑的首要基礎(chǔ)，對(duì)于提高RAC檢測(cè)的靈敏度及準(zhǔn)確性，有重要的影響。異源性ELISA檢測(cè)中，由于抗體對(duì)包被抗原的識(shí)別減弱，使得待測(cè)物能與抗體結(jié)合機(jī)會(huì)增加，與包被抗原充分競(jìng)爭(zhēng)，從而能檢測(cè)較低濃度的待測(cè)物，提高檢測(cè)靈敏度。且免疫半抗原與包被半抗原的差異性越大，檢測(cè)靈敏度越高[10]。半抗原的結(jié)構(gòu)對(duì)ELISA檢測(cè)靈敏度的影響，從高到低依次為連接位點(diǎn)、鏈接臂結(jié)構(gòu)、鏈接臂長(zhǎng)度。目前針對(duì)連接位點(diǎn)、鏈接臂結(jié)構(gòu)、鏈接臂長(zhǎng)度對(duì)RAC ELISA檢測(cè)靈敏度的影響的研究未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)是針對(duì)鏈接臂結(jié)構(gòu)對(duì)ELISA檢測(cè)靈敏度影響進(jìn)行研究。鏈接臂的選擇首先必須考慮其結(jié)構(gòu)有利于進(jìn)行蛋白質(zhì)與RAC的偶聯(lián)反應(yīng)；其次根據(jù)Wright等[11]提出的理論，鏈接臂越長(zhǎng)，產(chǎn)生高特異性抗體的可能性越低，因此鏈接臂的長(zhǎng)度必須合適；最后要求合成抗原純化方便。對(duì)氯甲基苯甲酸(CBA)易溶于無(wú)機(jī)相，在半抗原合成中，未參加反應(yīng)的CBA遇水便可析出，方便除去，而未反應(yīng)的RAC也可以在隨后的透析中被除去，抗原純化方便。本實(shí)驗(yàn)使用對(duì)CBA作為鏈接臂，通過(guò)混合酸酐法制備人工抗原，探索對(duì)CBA作為鏈接臂制備RAC人工抗原的方法及條件，并對(duì)其進(jìn)行初步鑒定。再與以戊二酸酐為鏈接臂制備的包被抗原(RAC-SA-OVA)比較不同半抗原對(duì)ELISA檢測(cè)靈敏度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

RAC(生物純) 武漢華美公司；CBA(分析純) 強(qiáng)中化工有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)美國(guó)Sigma公司；N,N-二甲基酰胺(DMF)、1,4-二氧六環(huán)、三正丁胺、氯甲酸異丁酯、無(wú)水乙醇等試劑均為分析純。

320-S pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；各種規(guī)格的移液槍 芬蘭雷勃公司；磁力攪拌器 德國(guó)IKA公司；WH-3漩渦混勻議 上海滬西分析儀器廠有限公司；SHZ-82氣浴恒溫振蕩器 榮華儀器設(shè)備有限公司；DU640紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Beckmen公司；蛋白質(zhì)電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；MK3酶標(biāo)儀、NICOLIT5700紅外光譜儀 美國(guó)熱電公司；可拆酶標(biāo)板美國(guó)康寧公司；冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司。

1.2 方法

1.2.1 RAC人工抗原的合成

稱(chēng)取34mg RAC溶于4mL DMF-1,4-二氧六環(huán)(體積比1:1)溶液中，加入20.5mg CBA，磁力攪拌室溫下反應(yīng)過(guò)夜，加入10μL三正丁胺，冰浴反應(yīng)10min，取出反應(yīng)物至室溫，加入7μL氯甲酸異丁酯，室溫下反應(yīng)2h；稱(chēng)取130mg BSA、45mg OVA分別溶解于10mL DMF-PBS-蒸餾水(體積比1:1:2)中；分別取5mL BSA、OVA溶液，0℃冰浴備用，各取600μL RAC-CBA溶液以每1滴/50s的速率分別滴加至BSA、OVA溶液中，期間用0.1mol/L NaOH溶液調(diào)整pH8.0左右，冰浴反應(yīng)4h，反應(yīng)液1000r/min離心10min，取上清4℃透析3d。冷凍干燥至粉末備用。

1.2.2 全抗原的鑒定

1.2.2.1 全抗原紅外光譜掃描

分別稱(chēng)取干燥的RAC-BSA全抗原2mg和KBr 200mg放入瑪瑙缽中，在紅外燈的照射下將混合物研磨均勻后，裝入壓片模具中，在8t壓力下壓制10min，壓制成厚度為1mm的透明KBr壓片，同樣方法制備BSA和RAC的KBr壓片后，用紅外光譜儀進(jìn)行掃描，得到紅外光譜圖。

1.2.2.2 全抗原紫外光譜掃描及偶聯(lián)比的計(jì)算

將RAC、BSA、OVA和兩種全抗原RAC-BSA、RAC-OVA用PBS稀釋成一定濃度的溶液，然后用DU460紫外掃描儀在波長(zhǎng)200～400nm處進(jìn)行紫外掃描，得到紫外吸光圖譜。根據(jù)公式(1)進(jìn)一步計(jì)算出兩種全抗原的濃度比，即偶聯(lián)比(c1/c2)[12]。

式中：OD274nm為全抗原在RAC最大吸收波長(zhǎng)處的光密度；OD’278nm為BSA在其最大吸收波長(zhǎng)處的光密度；ODB274nm為BSA在RAC最大吸收波長(zhǎng)處的光密度；OD278nm為全抗原在BSA最大吸收波長(zhǎng)處的光密度；OD’274nm為RAC在其最大吸收波長(zhǎng)處的光密度；ODB278nm為RAC在BSA最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度；c’1為RAC標(biāo)準(zhǔn)物的濃度；c’2為BSA標(biāo)準(zhǔn)物的濃度。

1.2.2.3 全抗原SDS-PAGE電泳

用蒸餾水分別稀釋RAC、BSA、OVA和兩種全抗原RAC-BSA、RAC-OVA，煮沸5min再冰浴5min，1000r/min離心5min，取上清。5%濃縮膠、16%分離膠，電極緩沖液為250mmol/L，Tris-HCl(pH8.3)，甘氨酸0.1% SDS。起始恒定電流2.1mA/cm濃縮樣品，溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，將電流調(diào)制3.0mA/cm，電壓為60V，直至溴酚藍(lán)條帶距封底膠約0.5cm時(shí)停止電泳，用0.025g/mL的考馬斯亮藍(lán)(R-250)染色，用25%的甲醇和10%的冰乙酸制成脫色液脫色至背景清晰。用凝膠成像儀得到電泳圖[13]。

1.2.3 動(dòng)物免疫

采用以戊二酸酐為鏈接臂制備的RAC-SA-BSA免疫原免疫小鼠制備抗血清。具體方法為：初免將人工抗原與弗氏完全佐劑1:1混合，采用皮下多點(diǎn)注射，免疫5周齡的雌性Balb/c小鼠；二免、三免、四免使用弗氏不完全佐劑替換弗氏完全佐劑與抗原1:1混合，同樣方法免疫Balb/c小鼠。四免后斷尾取血并用ELISA法檢測(cè)。

1.2.4 不同包被抗原對(duì)抗體親和力的影響

用間接ELISA法對(duì)比兩種包被抗原與抗體的親和力。具體如下： RAC-SA-OVA、RAC-CBA-OVA稀釋至5μg/mL包被酶標(biāo)板，每孔100μL，4℃靜置過(guò)夜后用1% PBST洗滌；加入380μL 3%脫脂牛奶封閉酶標(biāo)板，37℃溫育1h后洗滌；加入100μL梯度稀釋的抗體，抗體稀釋度為1:800～1:51200倍比稀釋?zhuān)?7℃溫育1h后洗滌；加入100μL酶標(biāo)羊抗小鼠IgG，37℃溫育1h后洗滌；加入100μL TMB顯色液，37℃溫育15min；加入50μL 2mol/L的H2SO4溶液終止顯色，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在波長(zhǎng)450nm處OD值為陽(yáng)性值。抗體滴度OD值為1.0時(shí)的抗體稀釋度。

1.2.5 不同包被抗原對(duì)ELISA檢測(cè)靈敏度的影響

用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)不同包被抗原對(duì)ELISA檢測(cè)靈敏度的影響。將1.2.4節(jié)中加梯度稀釋抗體一步改為加入50μL質(zhì)量濃度為0、4、10、20、40、100、140、200ng/mL RAC標(biāo)準(zhǔn)品及50μL最佳工作質(zhì)量濃度的RAC單抗，其余步驟相同，計(jì)算抑制率(IR)。半數(shù)抑制率IC50為抑制率達(dá)到50%時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)品質(zhì)量濃度。

式中：OD為加入競(jìng)爭(zhēng)品孔的OD值；OD0為競(jìng)爭(zhēng)品質(zhì)量濃度為0孔的OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 全抗原紅外光譜掃描結(jié)果

圖 1 RAC、BSA和RAC-BSA紅外掃描光譜圖Fig.1 IR spectra of RAC, BSA and RAC-BSA

如圖1所示，對(duì)比BSA和RAC-BSA人工抗原的紅外光譜圖在3500～2600cm-1和1900～1500cm-1區(qū)域出現(xiàn)了類(lèi)似的吸收峰，且明顯呈現(xiàn)蛋白質(zhì)吸收特點(diǎn)：3297cm-1處的胺基NüH吸收峰、1666cm-1和1549cm-1的兩個(gè)酰胺譜帶[14]等，判斷應(yīng)該是BSA中氨基酸產(chǎn)生的特征峰；同時(shí)，對(duì)照RAC和RAC-BSA人工抗原的紅外光譜圖發(fā)現(xiàn)它們?cè)?30cm-1附近有類(lèi)似的吸收出現(xiàn)，且BSA的紅外光譜圖不具備這個(gè)特點(diǎn)；另外在RAC-BSA全抗原的紅外光譜圖中還能找到1000～1280cm-1處出現(xiàn)的由于RAC與BSA偶聯(lián)而產(chǎn)生的CüN伸縮振動(dòng)吸收峰。綜上所述，可以得出結(jié)論在RAC-BSA的KBr壓片中含有RAC和BSA，且RAC-BSA人工抗原偶聯(lián)成功。

2.2 全抗原紫外光譜掃描結(jié)果

如圖2所示，RAC和BSA的最大吸收峰分別在波長(zhǎng)為274nm和278nm處；而RAC-BSA全抗原的最大吸收峰在波長(zhǎng)為276nm處，與BSA比較，波峰左移，證明人工抗原偶聯(lián)成功。同樣，RAC和OVA人工抗原的紫外光譜圖中看到相同情況，RAC-OVA全抗原的最大吸收與OVA比較同樣向左偏移，證明RAC-OVA人工抗原也偶聯(lián)成功。

圖 2 RAC、BSA和RAC-BSA紫外掃描光譜圖Fig.2 UV spectra of RAC, BSA and RAC-BSA

2.3 偶聯(lián)比的計(jì)算結(jié)果

RAC-BSA全抗原偶聯(lián)比為17.6:1；RAC-OVA全抗原的偶聯(lián)比為4.4:1。

2.4 全抗原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

圖 3 人工抗原SDS-PAGE圖Fig.3 Identif i cation of artif i cial antigens by SDS-PAGE

如圖3所示，RAC-BSA全抗原的泳動(dòng)速度小于BSA，可見(jiàn)RAC-BSA全抗原的分子質(zhì)量大于BSA，由此可以證明RAC與BSA已經(jīng)偶聯(lián)成功，同時(shí)，RAC-BSA全抗原的條帶在其相應(yīng)位置出現(xiàn)了一定程度的彌散現(xiàn)象，這是因?yàn)槊恳粋€(gè)BSA分子和RAC小分子偶聯(lián)的數(shù)目并不完全相同。使用紫外凝膠成像系統(tǒng)分析軟件分析后，得出BSA的分子質(zhì)量約66.2kD， RAC-BSA全抗原的分子質(zhì)量大約為73.5kD，全抗原中RAC與BSA的偶聯(lián)比約為18.9:1，與紫外掃描結(jié)果基本一致。OVA的結(jié)果為4.5:1，與紫外掃描結(jié)果基本相符。

2.5 抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

在包被抗原濃度等其他ELISA條件相同時(shí)，改變包被抗原種類(lèi)，則其在波長(zhǎng)450nm處的OD值反映了不同包被抗原對(duì)抗體的親和力，OD值越高，親和力越高。圖4為兩種包被抗原間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法中對(duì)應(yīng)的抗體稀釋曲線。相同抗體稀釋度下，RAC-SA-OVA的OD值略高于RAC-CBA-OVA，由圖計(jì)算二者的抗體滴度分別為17325.6和7047.3。由于與免疫半抗原具有不同的鏈接臂，降低了人工抗體對(duì)鏈接臂部分的識(shí)別，因此RACCBA-OVA對(duì)抗體的親和力略小于RAC-SA-OVA[15]。

提高ELISA檢測(cè)的靈敏度是優(yōu)化ELISA檢測(cè)方法的重要手段。圖5所示為間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的抑制曲線，在相同抑制率下，RAC-CBA-OVA組的競(jìng)爭(zhēng)品質(zhì)量濃度低于RAC-SA-OVA組。同時(shí)，半數(shù)抑制率IC50為判斷ELISA靈敏度的重要參數(shù)，包被RAC-CBA-OVA的ELISA檢測(cè)的IC50為17.05ng/mL低于包被RAC-SA-OVA的20.90ng/mL。由于CBA-OVA在ELISA檢測(cè)過(guò)程中與抗體結(jié)合力下降，使得抗體與RAC作用幾率增加，檢測(cè)的抑制率被提高，因此使用RAC-CBA-OVA做ELISA檢測(cè)包被抗原對(duì)檢測(cè)提高靈敏度有所幫助[16]。

圖 4 兩種包被抗原間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的抗體稀釋曲線圖Fig.4 Antibody dilution curves obtained using two different coating antigens

圖 5 兩種包被抗原間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的抑制曲線Fig.5 ELISA inhibition curves obtained using different coating antigens

3 討 論

食品中殘留的農(nóng)藥、抗生素及其他人為添加的有害成分的分子質(zhì)量普遍小于1kD，這些小分子物都屬于半抗原，即雖然具有抗原性，但不具備免疫原性，這是因?yàn)楦鶕?jù)小分子半抗原與大分子載體偶聯(lián)，即人工抗原[17]。小分子物質(zhì)的免疫分析研究的關(guān)鍵在于合成出高質(zhì)量的人工抗原。BSA和OVA由于具有穩(wěn)定的理化性質(zhì)、良好的溶解性以及具有較多容易修飾的官能團(tuán)，而被普遍認(rèn)為是比較合適的人工抗原載體蛋白，同時(shí)，人工抗原合成之后，對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的鑒定是十分必要的，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)人工抗原的鑒定主要目的在于判斷抗原是否偶聯(lián)成功、偶聯(lián)率的計(jì)算以及人工抗原的純度鑒定。通過(guò)紅外吸收光譜法、紫外吸收光譜法、SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)合成的人工抗原進(jìn)行綜合鑒定，表明對(duì)CBA作為鏈接臂的RAC人工抗原合成成功。同時(shí)，以對(duì)CBA為間接臂合成的RAC-BSA人工抗原其偶聯(lián)比與常用的以戊二酸酐連接的人工抗原偶聯(lián)比接近，且符合Schneider等[18]提出的有關(guān)人工免疫原最適宜偶聯(lián)比應(yīng)在10:1～20:1之間的要求，故可用于全抗原的合成。

根據(jù)有關(guān)包被抗原對(duì)ELISA檢測(cè)靈敏度影響的相關(guān)報(bào)道[19]，以對(duì)CBA為鏈接臂合成的RAC-OVA的偶聯(lián)比也較為適宜。同時(shí)，由于CBA和戊二酸酐在合成人工抗原時(shí)結(jié)合位點(diǎn)相同，而其結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度并不相同，兩者對(duì)比，能直觀地反映人工抗原鏈接臂在ELISA檢測(cè)靈敏度中的影響。Kim等[10]的報(bào)道中提到，改變包被抗原鏈接臂能在一定程度上減少連接臂對(duì)ELISA檢測(cè)靈敏度的干擾，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在以RAC-SA-BSA為免疫原的體系中，包被抗原RAC-CBA-OVA的親和力低于RAC-SAOVA，卻擁有更高的靈敏度，這是由于包被抗原與免疫抗原所采用的鏈接臂不同，減少了對(duì)抗體中鏈接臂部分識(shí)別的干擾，故對(duì)提高ELISA檢測(cè)靈敏性有積極作用。

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Synthesis and Characterization of Ractopamine Antigen Linked by 4-Methylbenzoic Acid

CHEN Chen1，LUO Shun-jing1,*，LIU Cheng-mei1，ZOU Chang-chun2，WANG Zhi-yu1，WANG Wen-fei1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technolog, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Asset Management Department, Nanchang University, Nanchang 330031, China)

The mixed anhydride method was used to prepare artif i cial antigen through the conjugation between ractopamine (RAC) and bovine serum albumin (BSA) in the presence of 4-chloromethyl benzoic acid (CBA). The prepared artif i cial antigen was identif i ed by IR, UV and SDS-PAGE. RAC-CBA was also conjugated with OVA to form a coating antigen. The aff i nity and inhibitory activity of the coating antigen were measured. This study suggests that CBA can be used to prepare artif i cial RAC antigens. Meanwhile, CBA conjugated with RAC to form coating agent improves the sensitivity of ELISA.

ractopamine；4-chloromethyl benzoic acid；ELISA sensitivity；artif i cial antigens

S859.84

A

1002-6630(2013)01-0180-05

2011-10-07

江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2010BNA09500)

陳臣(1982ü)，男，碩士，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生。E-mail：jordan0297@vip.sina.com

*通信作者：羅順菁(1969ü)，女，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：luoshunjing@yahoo.com.cn