南瓜酒抗氧化活性及其與VC、多酚和多糖含量的關(guān)系

張靖媛，吳 昊，王鳳舞，張宏斌，王成榮,*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 青島 266100)

南瓜酒抗氧化活性及其與VC、多酚和多糖含量的關(guān)系

張靖媛1，吳 昊1，王鳳舞1，張宏斌2，王成榮1,*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 青島 266100)

采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH自由基)法、羥自由基(?OH)體系和超氧陰離子自由基(O2—?)體系對(duì)南瓜酒的抗氧化活性進(jìn)行研究，并分析南瓜酒中VC、多酚和多糖含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性。結(jié)果表明：南瓜酒對(duì)DPPH自由基、?OH和O2—?均具有較強(qiáng)的清除效果，且呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，其清除效果優(yōu)于相同用量條件下的南瓜提取液；同時(shí)表明VC、多酚和多糖是南瓜酒的主要抗氧化活性成分。

南瓜酒；DPPH自由基；羥自由基；超氧陰離子自由基

研究表明，果蔬中富含的多酚、VC、類胡蘿卜素及VE等抗氧化成分具有預(yù)防癌癥和心血管疾病發(fā)生、抑制由過(guò)量自由基引起的炎癥、衰老等多種疾病的生理作用[1-4]。南瓜果實(shí)富含各種維生素、礦物質(zhì)、果膠、類胡蘿卜素、氨基酸、多糖和生物堿等營(yíng)養(yǎng)成分和活性成分[5-6]，具有多種食療保健作用和藥用價(jià)值。目前，對(duì)新型南瓜精深加工產(chǎn)品üü南瓜酒的研究多集中在加工工藝對(duì)其品質(zhì)的影響[7-9]，對(duì)其抗氧化活性的研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基法、羥自由基(?OH)法和超氧陰離子自由基(O2—?)法對(duì)南瓜酒的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，為南瓜酒的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南瓜為小磨盤(pán)品種，2010年11月購(gòu)于青島城陽(yáng)蔬菜批發(fā)市場(chǎng)；SY酵母(Q/YB.J02.5) 湖北安琪酵母股份有限公司；果膠酶(30000U/g) 天津利華酶制劑技術(shù)有限公司；糖化酶(80000U/g) 邢臺(tái)萬(wàn)達(dá)生物工程有限公司；南瓜酒(酒精度8.0%)為自釀。

抗壞血酸(VC)、草酸、2,6-二氯酚靛酚、福林酚、碳酸鈉、濃硫酸、苯酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鄰菲羅啉、硫酸亞鐵、雙氧水、鄰苯三酚、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚等均為國(guó)產(chǎn)分析純；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HH.S11-1型電熱恒溫水浴鍋 龍口市先科儀器公司；SL-300型榨汁機(jī) 天津市達(dá)康電器有限公司；MSZ02500正壓過(guò)濾器 上海摩速器材有限公司；MLS-3750型SANYO立式高壓滅菌鍋 日本三洋電器集團(tuán)；754型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；TGL-10B高速臺(tái)式離心機(jī)、GL-20C冷凍離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 南瓜提取液的制備

取新鮮南瓜10g，加入10mL 80%乙醇溶液研磨提取，10000r/min冷凍離心15min，取上清液，殘?jiān)貜?fù)提取2次，合并上清液定容至50mL。

1.3.1.2 南瓜酒的制備

南瓜酒釀造工藝：南瓜→去皮籽→切片→熱燙→打漿→酶解→過(guò)濾→滅菌→調(diào)整→添加SO2→接種酵母菌→發(fā)酵→過(guò)濾→除菌→成品。

操作要點(diǎn)：按質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.16%和0.30%添加果膠酶和糖化酶，50℃條件下酶解1.5h；添加蔗糖并用手持式糖度計(jì)測(cè)定糖度，將初始糖度調(diào)整為18%，殺菌后添加80mg/L的SO2，并接種已活化的酵母菌，接種量0.10%，發(fā)酵溫度25.8℃，于生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵130h。

1.3.2 VC含量的測(cè)定

采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[10]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 多酚含量的測(cè)定

采用Folin-Ciocalteau法[11]進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果以沒(méi)食子酸計(jì)。

1.3.4 多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[12]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 南瓜酒的抗氧化能力測(cè)定

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參考Shimada[13]、Brandwilliams[14]等的方法并改進(jìn)。將25mg/L的DPPH自由基醇溶液加入到2mL含有0.4、0.7、1.0、1.3、1.6mL樣品的水溶液中。于避光處37℃水浴30min，于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以1g/L的VC作為陽(yáng)性對(duì)照。以蒸餾水作為空白對(duì)照。DPPH自由基清除率按式(1)計(jì)算。

式中：A0為空白對(duì)照在517nm波長(zhǎng)處的吸光度；A1為樣品在517nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.5.2 gOH清除率的測(cè)定

采用鄰二氮菲-金屬鐵離子-H2O2體系[15-16]。取pH7.4、0.2mol/L的磷酸緩沖液4.0mL和蒸餾水16.0mL于試管中，混勻作為空白管；取4.0mL磷酸緩沖液、3.0mL鄰二氮菲(5.0mmol/L，以蒸餾水將50mmol/L鄰二氮菲無(wú)水乙醇溶液稀釋)、2.0mL 7.5mmol/L的FeSO4和11.0mL蒸餾水于試管中，混勻作為未損傷管；取4.0mL磷酸緩沖液、3.0mL鄰二氮菲、2.0mL FeSO4、9.0mL蒸餾水和2.0mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的H2O2于試管中，混勻作損傷管；取4.0mL磷酸緩沖液、3.0mL鄰二氮菲、2.0mL FeSO4、 2.0mL H2O2和9.0mL含有0.4、0.7、1.0、1.3、1.6mL樣品的水溶液，混勻作樣品管(其中H2O2為最后添加)。將上述各組加樣搖勻后于37℃水浴60min，于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以1g/L的VC作為陽(yáng)性對(duì)照。gOH清除率按式(2)計(jì)算。

式中：A樣品為樣品管在510nm波長(zhǎng)處的吸光度；A損傷為損傷管在510nm波長(zhǎng)處的吸光度；A未損為未損傷管在510nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.5.3 O2—?清除率的測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法[17]。在試管中加入6.0mL pH8.2的Tris-HCl緩沖液，2mL含有0.4、0.7、1.0、1.3、1.6mL樣品的水溶液，(25.0f0.5)℃水浴平衡20min后，加入0.6mL 7mmol/L的鄰苯三酚準(zhǔn)確反應(yīng)3min，加入1mL 10mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，于420nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以1g/L的VC作為陽(yáng)性對(duì)照。以蒸餾水作為空白對(duì)照。O2—?清除率按式(3)計(jì)算。

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光度；Ai為樣品組的吸光度；Aj為樣品溶液本身的吸光度，以蒸餾水代替顯色劑的吸光度。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Origin8.1和SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。所有樣品均平行測(cè)定3次，測(cè)定結(jié)果以fs表示；相關(guān)性分析采用相關(guān)系數(shù)法，顯著性界值為P＜0.05，極顯著界值為P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜酒對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖 1 南瓜酒對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.1 DPPH radical scavenging activity of pumpkin wine

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的深紫色自由基，加入抗氧化劑后，抗氧化劑可與其反應(yīng)生成無(wú)色的1,1-二苯基-2-三硝基苯胺[18]。由圖1可知，南瓜酒和南瓜提取液對(duì)DPPH自由基均具有清除作用，且在用量范圍內(nèi)呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。在用量為0.4～1.3mL時(shí)，南瓜酒對(duì)DPPH自由基清除率隨用量增加明顯增大，增幅為53.83%，當(dāng)用量進(jìn)一步增加至1.6mL時(shí)，南瓜酒對(duì)DPPH自由基清除率增幅不明顯，僅為5.10%，但超過(guò)了相同用量下VC對(duì)DPPH自由基的清除率。當(dāng)用量0.4mL時(shí)，南瓜提取液對(duì)DPPH自由基清除率為9.17%，當(dāng)用量為1.6mL時(shí)，清除率達(dá)到20.32%，增幅為11.15%。由此可見(jiàn)，南瓜酒對(duì)DPPH自由基清除效果明顯優(yōu)于南瓜提取液。

2.2 南瓜酒對(duì)?OH的清除能力

OH的清除作用Fig.2 Hydroxyl radical scavenging activity of pumpkin wine圖 2 南瓜酒對(duì)?

?OH是已知活性最強(qiáng)的氧化劑，在很多緩沖溶液中，只要產(chǎn)生?OH就會(huì)與緩沖溶液反應(yīng)，并且可以和所有細(xì)胞成分反應(yīng)，對(duì)機(jī)體危害極大[19]。由圖2可知，在0.4～1.0mL用量范圍內(nèi)，南瓜酒對(duì)?OH清除率隨用量增加明顯增大，增幅為24.87%，繼續(xù)增加用量，清除率增幅變緩，在南瓜酒用量超過(guò)0.7mL時(shí)，對(duì)?OH清除率明顯高于VC。南瓜提取液在整個(gè)實(shí)驗(yàn)用量范圍內(nèi)對(duì)?OH清除率呈緩慢上升趨勢(shì)，增幅均小于南瓜酒。由此可見(jiàn)，南瓜酒對(duì)?OH清除能力優(yōu)于南瓜提取液和VC。

2.3 南瓜酒對(duì)O2—?的清除能力O2

Superoxide anion radical scavenging activity of pumpkin wine的清除作用Fig.3圖 3 南瓜酒對(duì)O-2g

—?是一種有氧激發(fā)的自由基，正常情況下，細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等抗氧化酶類可以及時(shí)將其清除，因此對(duì)機(jī)體無(wú)有害影響。病理?xiàng)l件下，由于O2—?的生成過(guò)多和機(jī)體抗氧化酶類活性下降，導(dǎo)致體內(nèi)O2—?大量積累而對(duì)細(xì)胞造成損傷[20-21]。由圖3可知，在實(shí)驗(yàn)用量范圍內(nèi)，南瓜酒和南瓜提取液對(duì)O2—?清除率呈劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)用量為0.4mL時(shí)，其清除率分別為32.62%和23.09%，用量增加到1.6mL時(shí)，清除率分別為49.40%和43.73%，前者明顯高于后者，但均未超過(guò)VC對(duì)O2—?的清除率。

鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化釋放出O2—?，并生成一系列有強(qiáng)烈光吸收的中間產(chǎn)物。由圖4的南瓜酒和南瓜提取液在O2—?清除體系中的動(dòng)力學(xué)曲線可知，在3min的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，加入南瓜提取液的體系其吸光度始終高于加入南瓜酒的體系，說(shuō)明加入南瓜提取液的體系中鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物顏色深，O2—?濃度較高，進(jìn)一步說(shuō)明南瓜酒對(duì)O2—?清除能力優(yōu)于南瓜提取液。

圖 4 吸光度隨時(shí)間變化的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.4 Dynamic changes in the absorbance of pumpkin wine and pumpkin extract over time

2.4 南瓜酒清除不同自由基能力的比較

圖 5 南瓜酒對(duì)3種自由基的清除效果Fig.5Comparison of scavenging activity of pumpkin wine against DPPH, hydroxyl and superoxide anion radicals

由圖5可知，在相同的1.0mL用量條件下，南瓜酒對(duì)DPPH自由基、?OH、?的清除率明顯不同，分別為69.68%、36.46%、46.95%，其對(duì)不同自由基清除效果依次為DPPH自由基＞?＞?OH。

2.5 南瓜酒中VC、多酚、多糖與抗氧化能力及不同抗氧化測(cè)定方法間的相關(guān)性分析

經(jīng)測(cè)定，南瓜酒中VC、多酚和多糖含量分別為6.75、71.47、10.21mg/L。由表1可知，南瓜酒對(duì)DPPH自由基、?OH、O2—?的清除效果與VC、多酚和多糖含量之間存在顯著的相關(guān)性(P＜0.05)，其中南瓜酒對(duì)DPPH自由基清除效果與VC、多酚和多糖含量以及對(duì)?OH清除效果與多糖含量之間均達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。表明南瓜酒的抗氧化作用與其中的VC、多酚和多糖含量之間存在顯著相關(guān)性，即南瓜酒的抗氧化作用與其中所含的VC、多酚和多糖有關(guān)。為明確各成分在清除自由基時(shí)是否存在干擾，進(jìn)行了偏相關(guān)性分析，由表2可知，P＞0.05，說(shuō)明3種成分在清除DPPH自由基、gOH及O2—g時(shí)不存在顯著相關(guān)性，即VC、多酚和多糖清除自由基時(shí)沒(méi)有表現(xiàn)出增效作用。

表1 南瓜酒活性物質(zhì)與抗氧化活性的相關(guān)性Table 1 Correlation between active components and radical scavenging activity of pumpkin wine

表 2 南瓜酒抗氧化活性與各活性物質(zhì)的偏相關(guān)性Table 2 Partial correlation between active components and radical scavenging activity of pumpkin wine

表 3 不同抗氧化性測(cè)定方法的相關(guān)性分析Table 3 Partial Correlation among scavenging activity of pumpkinwine against DPPH, hydroxyl and superoxide anion radicals

由表3可知，DPPH自由基法與O2—?法分析結(jié)果具有極顯著正相關(guān)性(P＜0.01)；DPPH自由基法與?OH法分析結(jié)果、?OH法與O2—?法分析結(jié)果之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.754和0.566，不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的相關(guān)性(P＞0.05)。

3 討 論

抗氧化活性的研究方法分為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)兩類，其中體外實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、快捷，應(yīng)用較多。體外測(cè)定抗氧化及自由基清除能力的方法包括分光光度法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法、色譜法、電子自旋共振法、毛細(xì)管凝膠電泳法等。由于作用機(jī)理不同，抗氧化劑在不同的體系或介質(zhì)中顯示出不同的抗氧化或促氧化作用，所以對(duì)任何一種抗氧化劑的評(píng)估都與實(shí)驗(yàn)體系緊密相關(guān)，單一的體系往往很難全面體現(xiàn)其生物學(xué)意義，需要多種體系相互補(bǔ)充，來(lái)研究其在不同體系的真實(shí)效應(yīng)[22]。南瓜酒作為一個(gè)復(fù)雜的混合體系，評(píng)估其抗氧化活性也是如此。本實(shí)驗(yàn)采用DPPH自由基法、?OH法、O2—?法對(duì)南瓜酒的抗氧化性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，南瓜酒對(duì)3種自由基均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除效果，且清除能力明顯優(yōu)于新鮮南瓜提取液，說(shuō)明南瓜發(fā)酵成南瓜酒，能有效提高其抗氧化活性和功能性。

對(duì)南瓜酒中活性成分與其抗氧化能力的相關(guān)性進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，VC、多酚和多糖與DPPH自由基、?OH和O2—?清除能力均存在顯著相關(guān)性。其中南瓜酒清除DPPH自由基和O2—?時(shí)，VC、多酚和多糖均做出了重要貢獻(xiàn)；清除?OH時(shí)，VC和多糖起主要作用。對(duì)其他果蔬和果蔬汁中VC和多酚與抗氧化活性之間關(guān)系的研究結(jié)果[23-25]與本實(shí)驗(yàn)相一致。多酚的抗氧化性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，其主要的活性結(jié)構(gòu)包括羥基、甲基化、聚合度、糖苷化等[26]，南瓜酒中究竟是多酚的哪一種或幾種活性結(jié)構(gòu)對(duì)其抗氧化活性做出了貢獻(xiàn)，尚需做進(jìn)一步的研究。柳紅[27]對(duì)南瓜提取物多糖清除?OH和O2—?的研究得出了與本實(shí)驗(yàn)一致的結(jié)果。對(duì)不同來(lái)源的多糖抗氧化活性研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，多糖分子上的還原性醛羥基和羥基可使具有高度氧化性的自由基還原，阻止自由基的連鎖反應(yīng)[27]，說(shuō)明這2種結(jié)構(gòu)是使多糖表現(xiàn)出抗氧化能力的重要結(jié)構(gòu)。芮海云等[28]研究白芨多糖的抗氧化性時(shí)進(jìn)一步證明了這一觀點(diǎn)，即硫酸酯化的白芨多糖能有效抑制反應(yīng)體系中O2—?的產(chǎn)生，提示化學(xué)修飾使原來(lái)包裹在內(nèi)的羥基裸露出來(lái)。

南瓜酒中除VC、多酚和多糖幾種生理活性成分含量與其抗氧化活性密切相關(guān)外，其他成分如自由氨基酸、肽類和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物等對(duì)其抗氧化活性是否做出了貢獻(xiàn)，有待于進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

南瓜酒對(duì)DPPH自由基、?OH、O2—?均具有較強(qiáng)的清除能力，且清除效果呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系；南瓜酒的抗氧化活性明顯優(yōu)于相同用量條件下的南瓜提取液；VC、多酚和多糖是南瓜酒的主要抗氧化活性成分。

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Correlation between Antioxidant Activity and Contents of VC, Polyphenols and Polysaccharides in Pumpkin Wine

ZHANG Jing-yuan1，WU Hao1，WANG Feng-wu1，ZHANG Hong-bin2，WANG Cheng-rong1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China；2. Qingdao Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266100, China)

The antioxidant potential of pumpkin wine was evaluated by measuring its scavenging activity against DPPH, hydroxyl and superoxide anion radicals and analyzed for its correlation with the contents of VC, polyphenols and polysaccharides. Pumpkin wine had strong scavenging activity against DPPH, hydroxyl and superoxide anion radicals in a dosedependent fashion, and its radical scavenging activity was better than that of pumpkin extract at the same dose. Meanwhile, our results suggested that VC, polyphenols and polysaccharides were the dominant antioxidant components in pumpkin wine.

pumpkin wine；DPPH radical；hydroxyl radical；superoxide anion radical

TS201.4

A

1002-6630(2013)01-0078-05

2011-11-11

山東省現(xiàn)代蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系

張靖媛(1987ü)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣麡?shù)深加工。E-mail：hollad_1@163.com

*通信作者：王成榮(1958ü)，男，教授，研究方向?yàn)楣呱罴庸ぜ百A藏。E-mail：qauwcr@126.com