煎煮時間對關木通中馬兜鈴酸A煎出量的影響

王世信　楊美娜

（河北省滄州中西醫(yī)結合醫(yī)院，滄州061000）

煎煮時間對關木通中馬兜鈴酸A煎出量的影響

王世信楊美娜

（河北省滄州中西醫(yī)結合醫(yī)院，滄州061000）

目的 研究不同煎煮時間對關木通的水煎液中馬兜鈴酸A的含量的影響。方法 定性鑒別：采用薄層層析法對關木通水煎液中的馬兜鈴酸A進行定性鑒別：以甲苯：乙酸乙酯：甲酸：水 （20∶10∶1∶1）作為展開劑，以馬兜鈴酸A標準品作為對照進行薄層分析。定量分析：采用高效液相色譜法對馬兜鈴酸A進行含量測定。色譜條件：C18柱；流動相：甲醇：水：冰醋酸 （72∶27∶1）；檢測波長：315nm；流速：1.0ml／min；柱溫：25℃。結果 結果顯示：①在可見光下，供試品溶液中在與標準品溶液相應的位置上有淡黃色斑點；在365nm紫外光下，斑點為暗斑。②在0.522～5.22μg范圍內(nèi)，馬兜鈴酸A的峰面積與濃度呈良好的線性關系。結論 不同煎煮時間下的關木通水煎液都有馬兜鈴酸A溶出，但是一定時間內(nèi)，煎煮時間越長，馬兜鈴酸A煎出越多。煎煮時間不變，延長濃縮時間會使馬兜鈴酸A含量減少。

關木通；馬兜鈴酸A；煎煮時間；高效液相色譜法；薄層色譜法

關木通（Caulis Aristolochiae Manshuriensis，CAM）為馬兜鈴植物東北馬兜鈴Aristolochia manshruiensis Kom的干燥藤莖。關木通苦寒有毒，有清心火、利小便、通經(jīng)下乳之功效，用于口舌生瘡、心煩尿赤、水腫、熱淋澀痛、白帶、經(jīng)閉乳少、濕熱通痹等?，F(xiàn)代研究表明其藥理作用有利尿、抗突變、抗腫瘤及降血壓的作用［1］。關木通的主要化學成分為馬兜鈴酸A、B、D，馬兜鈴苷，馬兜鈴D甲醚，木蘭花堿等。其中馬兜鈴酸為主要毒性成分，且含量最大，易導致慢性腎功能衰竭［2］。2003年6月國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)出通知取消其藥用標準，這意味著關木通從此不能作為一種合法中藥使用。為此，業(yè)內(nèi)人士一直在尋求降低馬兜鈴酸浸提率的方法，以求讓關木通擺脫有嚴重副作用的困擾，重新發(fā)揮它優(yōu)越的作用。本實驗從煎煮時間及濃縮時間的角度分別利用薄層色譜法和高效液相法研究了關木通中馬兜鈴酸A含量的變化。

1　材料與方法

1.1儀器與藥品

1.1.1儀器高效液相色譜儀（安捷倫1200），色譜柱XDB C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；安捷倫1200色譜工作站（浙江大學）；TG328B型分析天平；不銹鋼鍋，燃氣灶，SHZ-D循環(huán)水式真空泵，DRT電熱套（220V），KQ-500DV數(shù)控超聲波清洗儀，圓底燒瓶，冷凝管，分液漏斗，10ml容量瓶，冰箱，展缸，紫外燈，玻璃板，毛細玻璃管等。

1.1.2藥品甲醇為色譜純，95%乙醇、鹽酸、三氯甲烷、甲苯、乙酸乙酯、甲酸 （均為分析純，購于南京化學制劑廠），硅膠G（上?；瘜W制劑公司），關木通藥材（購于樂仁堂藥店），馬兜鈴酸A標準品 （購于中國藥品生物制品檢定所，批號：110713-200708）。

1.2薄層色譜法檢測馬兜鈴酸A

1.2.1薄層板的制備稱取10g硅膠G于研缽中，到入約30ml CMC-Na溶液，攪拌使之均勻且無氣泡。均勻鋪于干凈的玻璃板上，晾干，備用。

1.2.2供試品溶液制備分別精稱10g關木通藥材置兩個不銹鋼鍋中，并標記作為兩個實驗組。分別加入300ml水浸泡2小時后，分別煎煮兩次（一煎分別為45分和30分，二煎分別為30分和20分），合并兩次煎液，濃縮至100ml。冷卻后分別加入1.5倍95%乙醇，靜置過夜。抽濾，棄去沉淀。回收乙醇，冷卻，用鹽酸調(diào)PH至1，用三氯甲烷萃取至無色（10～15ml／次）?；厥杖燃淄橹辽倭繒r，移至蒸發(fā)皿中揮干，用甲醇溶解殘渣，定容至10ml，并標記。于4℃冷藏，備用，待測。

1.2.3標準品溶液制備取馬兜鈴酸A標準品0.2610g，用甲醇定容至1ml，作為標準品溶液。

1.2.4陰性對照溶液的制備向鍋中加入300ml水，根據(jù)供試品溶液的制備方法制備。

1.2.5薄層層析條件分別吸取上述兩種供試品溶液、陰性對照溶液和標準品溶液各4μl，點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸∶水 （20∶10∶1∶1）展開。取出，晾干，于365nm紫外燈下觀察。

2　結果

在可見光下，供試品溶液中在與標準品溶液相應的位置上有淡黃色斑點；在365nm紫外光下，斑點為暗斑。

2.1高效液相色譜法測定關木通中馬兜鈴酸A的含量

2.1.1色譜條件色譜柱：XDB C18柱（250mm× 4.6mm，5μm）；流動相∶甲醇∶水∶冰醋酸（72∶27∶1）；檢測波長：315nm；柱溫：25℃；流速：1.0ml／min；進樣量：5μl；理論塔板數(shù)以馬兜鈴酸A峰計應不低于2900。

2.1.2對照品溶液的制備取馬兜鈴酸A標準品，精密稱定5.2219mg，置于10ml容量瓶中，用適量甲醇稀釋，將容量瓶置于超聲波清洗器中超聲使充分溶解，用甲醇定容至刻度，搖勻即得（0.5220mg／ml）。

2.1.3供試品溶液的制備同1.2.2。

2.1.4陰性對照溶液的制備同1.2.3。

2.2系統(tǒng)適應性實驗精密吸取2.1項下已制備好的對照品、供試品和陰性空白樣品溶液，照2.1.1項下色譜條件，各進樣10μL，理論塔板數(shù)按馬兜鈴酸A峰計算不低于2900，色譜圖見圖1-4。

圖1　高效液相色譜圖 （標準品）

圖2　高效液相色譜圖（樣品1）

圖3　3高效液相色譜圖（樣品2）

圖4　高效液相色譜圖 （陰性對照）

2.3線性關系考察分別精密吸取對照品溶液（濃度為0.522mg／ml）1ml，2ml，4ml，6 ml，8 ml，10ml至10ml容量瓶中，用甲醇定容。按上述色譜條件進樣檢測，測定其峰面積值，并以馬兜鈴酸A峰面積Y為縱坐標，對樣品中馬兜鈴酸A進樣量X進行回歸，求得標準曲線方程y=2121.5x+2.995；r=0.9999。結果表明在0.522～5.22μg范圍內(nèi)，馬兜鈴酸A的峰面積與濃度呈良好的線性關系。

2.4精密度實驗精密吸取稀釋至0.261mg／ml的對照品溶液，連續(xù)進樣6次，在上述條件下進行HPLC分析。RSD=0.07%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5重現(xiàn)性實驗精密稱取關木通藥材，按1.2.2項下樣品1的方法制備六份樣品供試品溶液，分別進行測定。測定其濃度的平均值為0.356，RSD為0.81%（n=6），表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.6穩(wěn)定性實驗精密稱取關木通藥材適量，按1.2.2項下樣品1操作制備供試品溶液，分別于第0，1，2，4，8，12，24小時在上述色譜條件下進行HPLC分析。結果RSD=0.28%（n=7），表明供試品穩(wěn)定。

2.7加樣回收試驗精密稱取關木通藥材6份，精密加入一定量的馬兜鈴酸A標準品溶液，按1.2.2項下樣品2操作制成供試品溶液，在上述色譜條件下進行HPLC分析，結果平均回收率為99.58，RSD為1.17%（n=6），表明該方法具有良好的回收率。

2.8樣品測定 精密稱取關木通藥材，按1.2.2項下操作制成供試品溶液，在上述色譜條件下進行HPLC分析，結果樣品1（煎煮時間長）的馬兜鈴酸A含量為0.354mg／ml，樣品2（煎煮時間短）的馬兜鈴酸A含量為0.160mg／ml。

3　討論

馬兜鈴酸系一類具有明確腎毒性的物質(zhì)，長期或過量服用易導致癌癥或腎衰竭等。近年來，國內(nèi)外已經(jīng)有不少因為服用馬兜鈴酸過量而導致腎衰竭的病例。然而馬兜鈴屬植物具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗生育以及對心血管的藥理作用在臨床上是毋容置疑的。但是含馬兜鈴酸的藥材因為其有腎毒性，被禁止使用，其藥用作用也隨之被否定，不免有“因噎廢食”之嫌。因此我們既不能一味排斥馬兜鈴酸的藥用價值，又不能無視毒性的存在。為了尋求控制馬兜鈴酸含量的方法，嚴格控制其含量范圍，以保證臨床用藥的安全，讓馬兜鈴屬植物重新為醫(yī)療事業(yè)服務，本實驗研究了不同煎煮時間對關木通中馬兜鈴酸A煎出量的影響。結果表明在一定時間內(nèi)，煎煮時間越長，馬兜鈴酸煎出量越多，煎煮時間越短，馬兜鈴酸煎出量越少。原因可能是煎煮時間越長，對藥材中馬兜鈴酸提取越充分，故而含量大。

另外，本實驗還研究了濃縮時間對馬兜鈴酸A含量的影響，當煎煮時間不變而單獨延長濃縮時間時，馬兜鈴酸A的含量有顯著降低。原因可能在于濃縮藥液中馬兜鈴酸A不再浸出，而同時馬兜鈴酸A在加熱條件下不穩(wěn)定［3］，高溫能夠有效的破壞馬兜鈴酸A，故而含量降低。因此，有效控制馬兜鈴酸A的釋放，可以從煎煮時間及濃縮時間兩個方面上進行調(diào)整。

［1］王瑛，潘競先，高建軍，等.中藥關木通中的抗腫瘤成分研究［J］.北京醫(yī)科大學學報，2000，32（1）：18.

［2］張金蓮，張的鳳，喻松仁.關木通配伍減毒研究進展［J］.江西中醫(yī)學院學報，2007，18（6）：74-6.

［3］王勇，夏博，鄧曉春.馬兜鈴酸Ⅰ在煎煮過程中的縮合反應研究［J］.中草藥. 2010，41（8）：1288-1292.

10.3969／j.issn.1672-2779.2013.04.112

：1672-2779（2013）-04-0161-03

張文娟

2013-01-25）