PCR 技術(shù)在黃淮白山羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌檢測中的應(yīng)用1)

華金玲 王立克 楊 芝 劉明明

(安徽科技學(xué)院，鳳陽，233100)

甲烷是與全球氣候變化密切相關(guān)的溫室氣體，其溫室效應(yīng)是二氧化碳的62 倍。反芻動物瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的甲烷通過噯氣排入大氣，全球每年反芻動物產(chǎn)生甲烷量約為77 t，占大氣中甲烷總量的l5%，并且每年以1%的速度增加［1］。反芻動物甲烷氣體排放造成的溫室氣體效應(yīng)占到氣候變暖因素作用的15% ～20%。因此，瘤胃甲烷菌的相關(guān)研究日益受到人們的關(guān)注，并進行了廣泛深入的研究。瘤胃產(chǎn)甲烷菌是一類嚴(yán)格厭氧的古菌，隸屬廣古菌門［2］。一般認(rèn)為，瘤胃甲烷菌以甲烷桿菌科數(shù)量最多，其次為甲烷微菌科［3］。瘤胃甲烷菌對條件要求高，培養(yǎng)難度大，再加一些甲烷菌存在不可培養(yǎng)且無法記數(shù)等原因，截至目前，美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)公布全基因組測序序列的產(chǎn)甲烷古菌有22株［4］。因此，應(yīng)用先進技術(shù)進行瘤胃甲烷菌的快速、準(zhǔn)確、靈敏檢測方法已成為瘤胃甲烷菌研究的發(fā)展方向。成艷芬等針對山羊瘤胃的真菌分離培養(yǎng)液分離出來的產(chǎn)甲烷菌進行16S rDNA 擴增、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、RFLP 及測序分析，探討山羊瘤胃真菌分離培養(yǎng)液中產(chǎn)甲烷菌的種類及其多樣性，表明山羊瘤胃真菌培養(yǎng)液中的多數(shù)瘤胃產(chǎn)甲烷菌是迄今未知的種屬［5］。Wright 等［6］利 用16S rRNA 基因庫和DGGE 技術(shù)檢測委內(nèi)瑞拉綿羊瘤胃內(nèi)的產(chǎn)甲烷菌，指出Methanobrevibacter 是其瘤胃的主要菌群。成艷芬等［7］利用ARISA 方法研究產(chǎn)甲烷菌共存及去除條件下瘤胃真菌多樣性，建立了快速可行的厭氧真菌多樣性分析方法。劉園園等［8］利用PCR－DGGE 探索水牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌的多樣性，獲得較好地分析水牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌的多樣性。郭嫣秋［9］利用實時定量PCR 方法研究了產(chǎn)甲烷菌和微生物菌群與甲烷生成的密切關(guān)系，并建立了瘤胃產(chǎn)甲烷菌活性檢測的實時定量PCR 檢測技術(shù)［9］。本研究通過采集安徽本地黃淮白山羊瘤胃內(nèi)瘤胃甲烷桿菌進行厭氧培養(yǎng)，并利用瘤胃產(chǎn)甲烷菌基因的特異性，進行引物設(shè)計，優(yōu)化PCR 擴增條件，從而探索PCR 技術(shù)在安徽黃淮白山羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌檢測中的應(yīng)用，并為建立快速、準(zhǔn)確的瘤胃產(chǎn)甲烷菌檢測技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 瘤胃甲烷桿菌的培養(yǎng)

1.1.1 瘤胃甲烷菌種的采集

黃淮白山羊屠宰后，及時取出瘤胃并在其上方開口將厭氧管深入瘤胃內(nèi)部液體中，待其裝滿后迅速取出，放進事先調(diào)好溫度的39 ℃保溫瓶中，帶回實驗室進行甲烷桿菌的接種培養(yǎng)。

1.1.2 BRN 厭氧培養(yǎng)基

甲烷桿菌培養(yǎng)采用BRN 厭氧培養(yǎng)基參照德國DSMZ 微生物菌種保藏中心。

配制方法:①按順序?qū) 溶液50 mL，B 溶液50 mL ，微量元素溶液10 mL，氯化銨1. 0 g，刃天青(0.1%)1 mL，乙酸鈉2.5 g，甲酸鈉2.5 g，酵母浸提物2.0 g，2－巰基磺酸鈉0.1 mg，蛋白胨2.0 g，無細(xì)胞瘤胃液300 mL(新鮮瘤胃液采集后，12 000 r/min下離心15 min，取上清液，重復(fù)1 次)，溶于去離子水，并加水至1 000 mL，加熱10 min 排出液體中的氧氣;②持續(xù)通入CO2，冷卻30 min;③待冷卻后加入5.0 g 碳酸氫鈉、0.5 g 九水合硫化鈉、1.0 g L－半胱氨酸鹽酸，使之溶解;④調(diào)整培養(yǎng)基的pH 到6.4 ～6.8;⑤在厭氧操作臺上進行Hungate 管分裝，每只Hungate 管裝入9 mL 培養(yǎng)基，然后115 ℃滅菌20 min。其中A 溶液為6 g 磷酸氫鉀，溶于蒸餾水并定容至1 000 mL，0 ～4 ℃保存，待用;B 溶液為6.00 g磷酸氫鉀，6.00 g 硫酸銨，12.00 g 氯化鈉，2.50 g 七水合硫酸鎂，0.16 g 二水合氯化鈣加蒸餾水溶解，定容至1 000 mL。

微量元素溶液為溶液1、溶液2 混合，并用1 mol/L 氫氧化鉀調(diào)整pH 值至7。加去離子水，定容至2 000 mL。其中溶液1 為1.50 g 次氮基三乙酸溶于600 mL 蒸餾水中，3 mol/L 氫氧化鉀調(diào)整pH 值至6.5;溶液2 為3.000 g 七水合硫酸鎂，0.450 g 二水合硫酸錳，1.000 g 氯化鈉，0.100 g 七水合硫酸亞鐵，0.180 g 七水合硫酸鈷，0.100 g 二水合氯化鈣，0 . 180 g 七 水 合 硫 酸 鋅，0. 010 g 五 水 合 硫 酸 銅，0.018 g 十二水合硫酸鋁鉀，0.010 g 硼酸，0.010 g二水合鉬酸鈉，0.100 g 六水合硫酸鎳，0.190 g 硒酸鈉，0.100 g 二水合鎢酸鈉，溶解于600 mL 去離子水中。

1.1.3 瘤胃甲烷菌的接種

利用1 mL 無菌注射器吸取采集的瘤胃菌種0.5 mL 于已滅菌的裝有BRN 厭氧培養(yǎng)基的Hungate 管中混勻，在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.1.4 純培分離接種

在1.1.3BRN 厭氧培養(yǎng)的基礎(chǔ)上加入0.25%的瓊脂，厭氧操作箱中分裝于培養(yǎng)皿中。將Hungate管中培養(yǎng)48 h 的甲烷桿菌在厭氧操作箱中接種于培養(yǎng)皿中，并于48 h 涂片革蘭氏染色生物顯微鏡(奧林帕斯)觀察。

1.2 瘤胃甲烷桿菌的檢測

1.2.1 引物設(shè)計

以產(chǎn)甲烷菌(Methanobrevibacte ruminatium)為檢測對象，引物設(shè)計參照Denman 等，以甲基輔酶M還原酶基因(MCR)為擴增的目的片段，引物上游5'－TTCGGTGGATCDCARAGRGC－3'，擴增保守氨基酸序 列 FGGSQR，下 游5' － GBARGTCGWAWCCGTAGAATCC－3'，擴增保守氨基酸序列GFYGYDL，擴增片段長度為140 bp，引物由上海生工生物合成。

1.2.2 基因DNA 的提取

采用CTAB 方法。取培養(yǎng)48 h 的甲烷桿菌于研缽中，加入800 μL CTAB 提取緩沖液(可依據(jù)量相應(yīng)增加)，研磨10 min。然后在70 ℃水浴中溫育20 min，10 000 r/min 離心10 min。保留上清液，并轉(zhuǎn)移至空白離心管中，加入酚/氯仿500 μL，渦旋成白色乳濁液，然后13 000 r/min 離心10 min。吸取500 μL 上清液體于空白離心管中，并加入異丙醇300 μL，離心管輕輕上下反復(fù)倒置數(shù)次。室溫下靜置5 ～10 min 使DNA 沉淀，然后13 000 r/min 離心15 min。去除上清液后，可見呈灰色的DNA 沉淀。用1 mL 70%乙醇，洗滌沉淀，并70 ℃溫育10 min，溫育期間手指輕彈離心管洗滌沉淀。然后離心13 000 r/min，10 min。去除上清液，沉淀物在室溫下干燥或烘箱中70 ℃干燥5 min。據(jù)沉淀物量多少可加入50 ～100 μL TE 重新懸浮沉淀，必要時可采用加熱促進其溶解。

1.2.3 瘤胃甲烷菌PCR 檢測

反應(yīng)體系與擴增條件:采用30.0 μL 反應(yīng)體系，即10×Buffer(NH4)2SO43.0 μL，MgCl21.8 μL，dNTP 1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA 模板5.0 μL，Tag 酶0.2 μL，加dd H2O 至30.0 μL。

PCR 的擴增條件:95 ℃，預(yù)變性，2 min;95 ℃，變性15 s，60 ℃，復(fù)性和延伸1 min，共40 個循環(huán);10℃保溫。

PCR 產(chǎn)物電泳檢測:PCR 反應(yīng)結(jié)束后，利用1.50%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測。電泳檢測利用EtBr 顯色，EtBr 溶解于瓊脂糖中，其終濃度為0.02 g/L。電泳時0.50% TBE 作為緩沖液，電壓恒定在120 V。電泳結(jié)束后，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察產(chǎn)物電泳結(jié)果，并將電泳結(jié)果拍攝保存。

2 結(jié)果與分析

瘤胃產(chǎn)甲烷菌在培養(yǎng)過程中需要添加酵母培養(yǎng)物、微量金屬元素如鎳、鈷、鐵等作為輔酶的組成。試驗配制的BRN 厭氧培養(yǎng)基滿足瘤胃甲烷桿菌的生長需求，相應(yīng)的厭氧環(huán)境也適宜瘤胃甲烷桿菌的生長，因此，瘤胃甲烷桿菌革蘭氏染色清晰可見(見圖1)。

瘤胃甲烷菌培養(yǎng)48 h 后，利用分子方法進一步檢驗。結(jié)果表明，瘤胃產(chǎn)甲烷菌(Methanobrevibacte ruminatium)引物設(shè)計具有特異性、專一性，PCR 擴增條件參數(shù)設(shè)定合理、準(zhǔn)確。PCR 結(jié)束后，擴增產(chǎn)物的凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物基因片段與目的片段相一致，擴增產(chǎn)物條帶單一明亮，并且出現(xiàn)在140 bp 的位置(見圖2)。

圖1 瘤胃甲烷桿菌厭氧培養(yǎng)48 h 形態(tài)(10×100 倍電子顯微鏡下觀察)

圖2 PCR 擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖

3 結(jié)論與討論

產(chǎn)甲烷菌中含有與甲烷生成密切相關(guān)的輔酶，如甲酰四氫甲基喋呤(THMP)、甲酰甲基呋喃(MFR)、輔酶F420(COF420)、輔酶M(HSCoM)、輔酶F430(COF430)以及輔因子B(HSHTP)等。瘤胃3 種甲烷生成方式最終都形成甲基輔酶M，甲基輔酶M 還原酶(MCR)是甲烷產(chǎn)生過程中的一個關(guān)鍵酶，存在于甲烷菌中，甲基輔酶M 在甲基輔酶M 還原酶I(MCR I)和甲基輔酶M 還原酶II(MCR II)的催化下最終形成甲烷［10］。其中MCR I 復(fù)合體的一個肽段mcrA 基因的編碼是利用PCR 技術(shù)檢測產(chǎn)甲烷菌的有效而穩(wěn)定的手段。尤其是在產(chǎn)甲烷菌的分離鑒定方面具有很好的應(yīng)用價值［11］。以mcrA 基因為目的片段的PCR 技術(shù)廣泛應(yīng)用于沼氣發(fā)酵、海洋以及稻田等環(huán)境中產(chǎn)甲烷菌的檢測。Springer 等［12］利用PCR 技術(shù)成功地分離鑒定了1 個已知的甲烷八疊球菌。Luton 等［13］改進mcrA 基因PCR 的引物，檢測垃圾場內(nèi)產(chǎn)甲烷菌的種類，并獲得成功，證實了利用mcrA 基因檢測甲烷菌的可靠性和穩(wěn)定性。本試驗設(shè)計的mcrA 基因的PCR 引物具有較強的專一性，在PCR 產(chǎn)物擴增后在引物對應(yīng)的位置亮帶明顯。結(jié)果表明，目標(biāo)甲烷菌在mcrA 基因引物設(shè)計、反應(yīng)體系、擴增參數(shù)、引物設(shè)計等正確的條件下，其特異性基因片段擴增的要求可以得到滿足，從而為黃淮白山羊瘤胃甲烷菌的進一步定量分析奠定了科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，本試驗的BRN 厭氧培養(yǎng)基是瘤胃甲烷桿菌體外培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基;以瘤胃甲烷桿菌甲基輔酶M 還原酶基因(MCR)為擴增的目的片段的引物(上游5'－TTCGGTGGATCDCARAGRGC－3'，下游5'－GBARGTCGWAWCCGTAGAATCC－3')，具有特異性、專一性，PCR 擴增條件參數(shù)設(shè)定合理，擴增產(chǎn)物特異性高。本試驗結(jié)果為黃淮白山羊瘤胃甲烷菌的檢測奠定了一定的理論依據(jù)，從而使瘤胃中不可培養(yǎng)甲烷菌的定性、定量檢測成為可能。

［1］ Moss A R，Jouany J P，Newbold J. Methane production by ruminants:its contribution to global warming［J］. Ann Zootech，2000，49(3):231－253.

［2］ Lange M，Ahring B K. A comprehensive study into the molecular methodology and molecular biology of methanogenic Archaea［J］.FEMS Microbiol Rev，2001，25(5):553－571.

［3］ Sharp R，Ziemer C J，Stern M D，et al. Taxon-specific associations between protozoal and methanogen populations in the rumen and a model rumen system［J］. FEMS Microbiol Ecol，1998，26(1):71－78.

［4］ 朱晨光，許政暟，宋任濤.產(chǎn)甲烷古菌［J］. 生命的化學(xué)，2009，29(1):129－133.

［5］ 成艷芬，毛勝勇，裴彩霞，等.共存于厭氧真菌分離培養(yǎng)液中瘤胃甲烷菌的檢測及其多樣性分析［J］. 微生物學(xué)報，2006，46(6):879－883.

［6］ Wright A D G，Ma X L，Obispo N E. Methanobrevibacter phylotypes are the dominant methanogens in sheep from Venezuela［J］.Microbial Ecology，2008，56(2):390－394.

［7］ 成艷芬，朱偉云.ARISA 方法研究產(chǎn)甲烷菌共存及去除條件下瘤胃真菌多樣性變化［J］.微生物學(xué)報，2009，49(4):504－511.

［8］ 劉園園，姜偉偉，秦紅玉，等.PCR－DGGE 技術(shù)在水牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌多樣性分析中的應(yīng)用［J］. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，42(9):1144－1147.

［9］ 郭嫣秋.瘤胃產(chǎn)甲烷菌定量檢測與微生物菌群調(diào)控研究［D］.杭州:浙江大學(xué)，2008.

［10］ 單麗偉，馮貴穎，范三紅.產(chǎn)甲烷菌研究進展［J］.微生物學(xué)雜志，2003，23(6):42－46.

［11］ Lutan P E，Wayne J M，Sharp R J，et al. The mcrA gene as an alternative to 16S rRNA in the phylogenetic analysis of methanogen populations in landfill［J］. Microbiology，2002，148:3521－3530.

［12］ Springer E，Sachs M，Woese C R，et al. Partial gene sequenees for the a subunit of methyl-coenzyme M reduetase (MCR I)as a phylogenetic tool for the family Methanosarcinaceae［J］. Int J Syst Bacteriol，1995，45:554－559.

［13］ Luton P E，Wayne J M，Sharp R J，et al. The mcrA gene as an alternative to 16S rRNA in the phylogenetic analysis of methanogen populations in landfill［J］. Microbiology，2002，148:3521－3530.