油松枯枝病病原菌的越冬方式及場所1)

高國平 李美卉 祁金玉 張中一 王月 楊 晨 王 紅

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，沈陽，110866)

油松(Pinus tabulaeformis Carr.)是遼寧省鄉(xiāng)土樹種，也是遼寧省重要的用材林和綠化樹種，但是近幾年，油松枯枝病在遼寧沈陽地區(qū)油松枝條上陸續(xù)發(fā)生，常成大量的油松枝條死亡，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致全株枯死。油松枯枝病的病原菌為鐵銹薄盤菌(Cenangium ferruginosum)和松梢枯叢赤殼菌(Nectria cucurbitula)，其無性分別是針葉樹歧裂殼菌(Dothichiza ferruginosa)和瘤座孢菌(Tubercularia sp.)［1－3］。我國目前有關(guān)松枝枯病的報道極少，僅見對松枯枝病的病原菌、生物學(xué)特性及防治技術(shù)的報道［4］，但關(guān)于油松枯枝病病原菌越冬場所及方式還缺乏研究。筆者在沈陽地區(qū)對油松枯枝病原菌的越冬方式及其越冬場所開展了研究，對于完善該病害的基礎(chǔ)理論及生產(chǎn)防治有重要意義。

1 研究區(qū)自然概況

遼寧省沈陽地區(qū)位于中國東北地區(qū)的南部，地處東經(jīng)122°25'09″ ～123°48'24″、北緯41°11'51″ ～43°02'13″，東西長115 km2，南北長205 km2，屬于北溫帶亞洲季風(fēng)氣候區(qū)的北緣，受季風(fēng)影響的濕潤和半濕潤暖溫帶大陸性氣候，年均氣溫7.4 ℃，極端最高溫度38 ℃，極端最低溫度－30.5 ℃，年均日照2 596.3 h，年平均無霜期155 d，年平均降水量750 mm，年蒸發(fā)量1 382 mm。

2 研究方法

2.1 越冬病原子實體觀察

于2011年12月至2012年2月，在沈陽市沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)、棋盤山風(fēng)景區(qū)及鐵西區(qū)勞動公園、和平區(qū)中山公園、和平區(qū)南湖公園、沈陽市抗美援朝烈士陵園等油松風(fēng)景林內(nèi)，隨機抽取發(fā)病木，借助放大鏡，用肉眼觀察其樹上的枯死枝條、褪綠枝條、落地枝條上是否有油松枯枝病病原子實體，并做詳細(xì)記錄。將觀察到帶有子實體的枯死枝條標(biāo)明編號、采集地點、采集時間，用塑料袋分裝保存帶回實驗室備用［5］。在室內(nèi)做病理切片后鏡檢，根據(jù)形態(tài)特點鑒定病原子實體有性、無性態(tài)的種類。

2.2 越冬病原營養(yǎng)體的檢測

病原營養(yǎng)體的分離培養(yǎng):在8 個調(diào)查地點采集表面無病原子實體的健康枝條，每個地點采集3 段長15 ～20 cm 的樣枝，帶回室內(nèi)。采用常規(guī)的組織分離法，將樣枝的皮層切成0.5 cm ×0.5 cm 的小段，經(jīng)0.1%的升汞溶液消毒后，用PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)，一個培養(yǎng)皿中放3 段組織(等腰三角狀)。置于LRH－250 －G 光照培養(yǎng)箱中，在室內(nèi)黑暗25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，每天觀察一次并記錄培養(yǎng)菌落的形狀、色澤及拍攝照片等。將出現(xiàn)的菌落進行純化再培養(yǎng)，與該病害病原菌子實體分離出的菌株外部形態(tài)特征進行對比。最后將獲得菌株編號保存在PDA 試管斜面上待用［6］。

病原營養(yǎng)體的分子檢測:對獲得的菌株分別提取其DNA，并以其為模板，采用ITS 通用引物(ITS1:5'－TCCG TAGG TGAA CCTG CGG－3'和ITS4:5'－TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC－3')對菌株的rDNA ITS序列進行PCR 擴增。對此片段進行DNA 序列測定，DNA 提取及測序工作由大連寶生物工程有限公司完成。同時以該病害病原菌分離菌株的DNA 序列作為對照，將所測菌株的基因序列和對照菌株的基因序列用DNAMAN 軟件進行同源性比較分析，最后確定測定菌株的種類是否屬于油松枯枝病原菌種類［7－9］。

3 結(jié)果與分析

3.1 病原子實體的越冬形式與場所

野外觀察只在油松枯死枝條上發(fā)現(xiàn)了2 種病原菌的有性、無性子實體。一般一個枝條上可見同一病原的無性和有性子實體，但也偶見同一枝條上2 種真菌的無性、有性子實體混生現(xiàn)象。從越冬場所來看，僅見枯死枝條上存在子實體，而落地枝條和樹上褪綠枝條上未檢查到病原子實體的存在。具體見表1。

表1 油松枯枝病野外越冬有性、無性子實體存在情況

3.2 越冬營養(yǎng)體的檢測

3.2.1 病原菌的分離培養(yǎng)特征

在8 個樣地分離的33 個樣品中分離獲得3 個菌株，其中勞動公園分離出1 個菌株(A)，中山公園分離出2 個菌株(B1、B2)，詳見表2。

表2 油松枯枝病病原菌分離培養(yǎng)記錄

獲得的3 個菌株形態(tài)為黃褐色圓形菌落;氣生菌絲，初期為白色絨毛狀，逐漸變黃褐色。3 個菌株的外部形態(tài)特征與鐵銹薄盤菌菌株的外部形態(tài)完全相似，與松梢枯叢赤殼菌有明顯區(qū)別。其它30 個分離樣品中，一些沒有長出菌落，一些雖長出菌落但卻是橘紅色或灰綠色的細(xì)菌或霉菌污染菌落。未分離出的原因可能是采集的樣枝沒有被病原菌侵染，或者分離過程被污染而失敗。

3.2.2 病原營養(yǎng)體的分子檢測結(jié)果

對菌株A、菌株B1、菌株B2、菌株CK 的rDNA ITS 測序結(jié)果表明:菌株A 的ITS 序列長度為516 bp，菌株B1 的ITS 序列長度為514 bp，菌株B2 的ITS 序列長度為517 bp，對照菌株CK 的ITS 序列長度為517 bp(具體見下列菌株擴增片斷)。將4 個菌株的基因序列用DNAMAN 進行同源性分析，去掉頭部和尾部可能造成測序不準(zhǔn)確的堿基，其他堿基完全一致，表明它們屬于同一物種。從培養(yǎng)的菌落形態(tài)和DNA 檢測結(jié)果可以確定從油松褪綠枝條皮下分離出的3 個菌株為鐵銹薄盤菌。各樣品基因片斷序列分別為:

4 結(jié)論與討論

油松枯枝病病原菌鐵銹薄盤菌和松梢枯叢赤殼菌都存在著有性子實體、無性子實體的越冬形式，而以營養(yǎng)體菌絲越冬的僅見于鐵銹薄盤菌。2 種病原菌的子實體一般在樹木當(dāng)年生的枯死枝條上越冬，而鐵銹薄盤菌的營養(yǎng)體菌絲則在油松健康枝條的皮下越冬。油松樹上褪綠枝條和落地枝條上未發(fā)現(xiàn)油松枯枝病2 種病原菌子實體存在。健康或褪綠枝條的皮下也未分離到松梢枯叢赤殼菌的營養(yǎng)體菌絲。枯枝上以鐵銹薄盤菌子實體居多，偶見2 種病原菌無性和有性子實體混生共存。

鐵銹薄盤菌和松梢枯叢赤殼菌均為弱寄生菌，在多種松樹上存在，前人僅發(fā)現(xiàn)了鐵銹薄盤菌以營養(yǎng)體菌絲的形式越冬［10］。本研究表明鐵銹薄盤菌不僅以營養(yǎng)體菌絲的形式越冬，還以有性、無性子實體的形式在樹木當(dāng)年生枯死枝條上越冬。但在油松枯死枝條上殘存的2 種病原菌子實體對油松的侵染能力，有待進一步研究。

［1］ 高國平，王允，祁金玉，等.沈陽市城區(qū)油松枝枯病病情及分析［J］.西北林學(xué)院學(xué)報，2012，27(3):105 －108.

［2］ 黃國強，李超，王慶華，等.松爛皮病發(fā)生規(guī)律與防治對策［J］.山東林業(yè)科技，2003 (4):33.

［3］ 孫美清，楊秀卿，趙偉，等.松樹枝枯病的研究進展［J］.中國森林病蟲，2001(4):27 －31.

［4］ 葛芳，張瑤琦，張浩洋，等.油松枯枝病病原菌生物學(xué)特性的研究［J］.遼寧林業(yè)科技，2009(4):21 －22.

［5］ 方中達(dá).植病研究方法［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

［6］ 陸燕君. 松樹枝枯病的發(fā)生與防治［J］. 山東林業(yè)科技，1990(3):34 －35.

［7］ 魏作全，黃桂菊，黎明，等.紅松爛皮病病原鑒定及致病性研究［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1990，21(2):115 －118.

［8］ 霍玉林，李廣武.煙臺赤松衰弱與死亡因子的探討［J］.森林病蟲通訊，1990(3):21 －22.

［9］ 魏作全，黃桂菊，黎明，等.紅松爛皮病病情及發(fā)病規(guī)律的研究［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1991，22(4):296 －301.

［10］ 張成丕，劉曉東，董曉彤.黑松枝枯病的綜合防治技術(shù)［J］.防護林科技，2000(3):113 －114.