補(bǔ)陽還五湯對急性脊髓損傷模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

侯兆陽 陳 哲 魏家森

補(bǔ)陽還五湯對急性脊髓損傷模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

侯兆陽1陳 哲2魏家森1

目的觀察補(bǔ)陽還五湯對大鼠急性脊髓損傷（ASCI）的治療作用及其機(jī)制。方法SD大鼠隨機(jī)分為空白組、損傷對照組、補(bǔ)陽還五湯組，各10只。采用Allen’s打擊法建立急性脊髓損傷模型，空白組和損傷對照組造模后予蒸餾水1mL灌胃，補(bǔ)陽還五湯組造模后予補(bǔ)陽還五湯1mL灌胃，均1天1次，連續(xù)3天。各組分別于術(shù)后1、7、14天觀察其行為學(xué)BBB評分，14天通過免疫組化的方法觀察脊髓損傷部位神經(jīng)細(xì)胞凋亡（caspase-3p20、Bcl-2與Bax）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)水平。結(jié)果①行為學(xué)觀察評分：術(shù)后7、14天補(bǔ)陽還五湯組與損傷對照組下肢功能均有恢復(fù)（P＜0.05），且補(bǔ)陽還五湯組較損傷對照組恢復(fù)更明顯［（9.05±0.95）分比（5.75±1.97）分，（12.6±1.55）分比（8.80±3.34）分，P＜0.05］。②免疫組化檢測：補(bǔ)陽還五湯組 caspsase-3p20 陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)較損傷對照組少［（16.70±2.21）個比（20.30±4.13）個，P＜0.05］；補(bǔ)陽還五湯組 Bcl-2 陽性細(xì)胞的表達(dá)較損傷對照組增加［（10.57±0.97）個比（6.42±3.20）個，P＜0.05］；補(bǔ)陽還五湯組 Bax陽性細(xì)胞的表達(dá)較損傷對照組少［（18.29±2.21）個比（21.14±2.41）個，P＜0.05］；補(bǔ)陽還五湯組 VEGF 陽性細(xì)胞的表達(dá)較損傷對照組多［（11.75±1.03）個比（9.50±1.30）個，P＜0.05］。結(jié)論補(bǔ)陽還五湯可提高脊髓損傷部位VEGF的表達(dá)，使細(xì)胞凋亡明顯減少，促進(jìn)骨髓功能的恢復(fù)。

大鼠；脊髓損傷；補(bǔ)陽還五湯；細(xì)胞凋亡；VEGF

急性脊髓損傷（acute spinal cord injury，ASCI）是指脊髓遭受到外力打擊后導(dǎo)致完全性或不完全性脊髓運(yùn)動、感覺、括約肌功能障礙等，是脊柱外科領(lǐng)域中一種常見的、創(chuàng)傷性極大、后果極其嚴(yán)重的疾病[1]。如何采用更為有效的措施來降低該病的致殘率并提高患者生活質(zhì)量，已成為目前脊柱外科臨床面臨的主要課題之一。補(bǔ)陽還五湯為傳統(tǒng)中藥方劑，臨床廣泛用于坐骨神經(jīng)痛、多發(fā)性神經(jīng)炎、糖尿病周圍神經(jīng)病變以及冠心病、腦卒中等病癥，療效顯著。本實(shí)驗(yàn)通過觀察補(bǔ)陽還五湯對急性脊髓損傷神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響，初步觀察其對ASCI的治療作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑 補(bǔ)陽還五湯：按原方比例取生黃芪 120g，當(dāng)歸尾 6g，赤芍 4.5g，地龍、川芎、紅花、桃仁各3g（購于浙江省新華醫(yī)院）。制備方法：加水回流提取2次，第一次加10倍水提取2h，第二次加8倍水提取1.5h，藥液過濾、合并濃縮至4g/mL，4℃保存。免疫組化試劑：caspase-3p20（批號 00980590）、Bcl-2（批號 20130224）、Bax（批號 20100701）、VEGF（批號

00980409）及相應(yīng)一抗均購自于上海源葉生物制品公司，二抗由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 儀 器 自制Allen’s打擊器、OlympusB顯微鏡等。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 體質(zhì)量200g左右健康SPF級SD大鼠30只，雌雄各半，購于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物合格證號：SCXK（滬）2013-0016，在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 急性脊髓損傷模型建立 采用Allen’s打擊法。大鼠以10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉，俯臥位固定，背部備皮，常規(guī)消毒，以T10為中心，沿正中線做約3cm縱行切口，依次切開皮膚、皮下筋膜，暴露椎旁肌，鈍性剝離肌肉暴露棘突、椎板和橫突。咬除T10棘突及全椎板至椎弓根部，部分咬除T9和T11椎板，暴露待損傷脊髓長約10 mm充分暴露T10對應(yīng)的脊髓。用自制改良的Allen’s撞擊器制備脊髓損傷動物模型，將重10 g的圓柱狀金屬棒沿細(xì)玻璃導(dǎo)管從6 cm高度自由落體，撞擊T10骨窗對應(yīng)的脊髓，造成急性脊髓損傷，擊打脊髓后，擊打棒不動，停留3 min再移開。撞擊成功標(biāo)準(zhǔn)為：撞擊脊髓組織水腫、出血，硬脊膜完整呈紫紅色，緊張，膨隆，大鼠尾巴出現(xiàn)痙攣性擺動，雙下肢軀體回縮樣撲動，呈遲緩性癱瘓。然后沖洗創(chuàng)口，逐層縫合椎旁肌肉和皮膚，肌注青霉素3天，同時(shí)每天擠壓膀胱排尿兩次以上，直至形成膀胱反射。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 30只SD大鼠先按性別分兩個區(qū)組并編號，后用隨機(jī)數(shù)字分配到空白對照組、損傷對照組和補(bǔ)陽還五湯組，每組10只?？瞻讓φ战M行棘突及全椎板切除，暴露脊髓，脊髓不損傷，術(shù)后蒸餾水1mL灌胃，連續(xù)3天；損傷對照組按Allen’s打擊法進(jìn)行造模，術(shù)后蒸餾水1mL灌胃，連續(xù)3天；補(bǔ)陽還五湯組按Allen’s打擊法進(jìn)行造模，造模成功后用制備好的補(bǔ)陽還五湯1mL，灌胃給藥，連續(xù)3天。飼養(yǎng)過程中各組死亡大鼠，后續(xù)重新造模補(bǔ)充。

2.3 后肢運(yùn)動神經(jīng)功能觀測指標(biāo) 采用Basso、Beattie、Bresnahan（BBB）（1996 年）評分法[2]。分別于造模后1、7、14天測定，由熟悉該評分標(biāo)準(zhǔn)的非本組實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行，觀察大鼠脊髓功能恢復(fù)情況。

2.4 組織灌注及標(biāo)本的制備 10%水合氯醛溶液3.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，麻醉成功后暴露心臟，于右心房剪口放血，左心室剪口行主動脈插管，后用肝素鹽水約150mL進(jìn)行心臟灌注，隨后用4%的甲醛溶液約150mL進(jìn)行心臟灌注，灌注成功后，固定約0.5h取以T10脊髓為中心約2.5cm脊髓，置于4%甲醛溶液固定。固定的頸髓依次進(jìn)行脫水、浸蠟、石蠟包埋，行橫切面5μm厚度連續(xù)切片。

2.5 免疫組織化學(xué)染色 caspase-3p20、Bcl-2、Bax、VEGF的表達(dá)采用免疫組化二步法，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。標(biāo)本進(jìn)行免疫組化測定：陽性表達(dá)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察（光鏡×400）：在鏡下主要表現(xiàn)為胞漿呈現(xiàn)棕黃色顆粒的神經(jīng)元，其數(shù)量越多，色越深，表明調(diào)控基因表達(dá)量越多，反之亦然。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD方法。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 BBB評分 手術(shù)前所有大鼠行為評分均為21分。術(shù)后空白對照組評分一直為21分，損傷對照組和補(bǔ)陽還五湯組術(shù)后1天行為評分均為0分，即雙下肢無活動，組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。7、14天損傷對照組和補(bǔ)陽還五湯組大鼠雙下肢運(yùn)動功能均得到一定程度的恢復(fù)（P＜0.05），補(bǔ)陽還五湯組較損傷對照組恢復(fù)更好（P＜0.05），見表1。

3.2 免疫組化結(jié)果 免疫組化顯示，caspsase-3p20陽性細(xì)胞：補(bǔ)陽還五湯組表達(dá)較損傷對照組少（P＜0.05），較空白對照組多（P＜0.05），說明補(bǔ)陽還五湯抑制脊髓損傷后caspase-3p20表達(dá)的增加；Bcl-2陽性細(xì)胞：補(bǔ)陽還五湯組的表達(dá)較損傷對照組多（P＜0.05），較空白對照組少（P＜0.05），說明補(bǔ)陽還五湯可抑制脊髓損傷后Bcl-2表達(dá)的減少；Bax陽性細(xì)胞：補(bǔ)陽還五湯組的表達(dá)較空白對照組多（P＜0.05），較損傷對照組少（P＜0.05），說明補(bǔ)陽還五湯可抑制脊髓損傷后Bax表達(dá)的增加；VEGF陽性的細(xì)胞：補(bǔ)陽還五湯組表達(dá)較損傷對照組多（P＜0.05），較空白對照組少（P＜0.05），說明脊髓損傷后VEGF的表達(dá)減少，補(bǔ)陽還五湯可增加VEGF的表達(dá)。見表2。

表1 各組術(shù)后1、7、14天BBB評分比較（分，±s）

表1 各組術(shù)后1、7、14天BBB評分比較（分，±s）

注：與 1 天比較，△P＜0.05；與損傷對照組比較，☆P＜0.05

組別空白對照組損傷對照組補(bǔ)陽還五湯組只數(shù)10 10 10 1天21 0 0 7天21 5.75±1.97△9.05±0.95☆△14天21 8.80±3.34△12.6±1.55☆△

表 2 各組 caspase-3p20、Bcl-2、Bax、VEGF 陽性細(xì)胞數(shù)比較（個，±s）

表 2 各組 caspase-3p20、Bcl-2、Bax、VEGF 陽性細(xì)胞數(shù)比較（個，±s）

注：與空白對照組比較，☆P＜0.05；與損傷對照組比較，★P＜0.05

組別空白對照組損傷對照組補(bǔ)陽還五湯組只數(shù)10 10 10 caspase-3p20 7.30±3.16 20.30±4.13☆16.70±2.21☆★Bax 7.00±2.16 21.14±2.41☆18.29±2.21☆★Bcl-2 18.42±2.76 6.42±3.20☆10.57±0.97☆★VEGF 14.25±2.58 9.50±1.30☆11.75±1.03☆★

4 討 論

ASCI可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個階段[3]。原發(fā)性損傷是指脊髓損傷時(shí)，由于骨折的移位、脫位或椎間盤脫入椎管及骨折片等刺入脊髓，對脊髓造成的直接壓迫、沖擊、撕裂、挫裂及剪切傷等，引起神經(jīng)細(xì)胞、軸突和血管的直接損傷；繼發(fā)性損傷是指由于原發(fā)性損傷導(dǎo)致的受損局部缺血、神經(jīng)生長因子缺乏、能量代謝紊亂、組織水腫等局部生化條件改變，從而引起的脊髓再損傷，其程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過原發(fā)性損傷[4]。而這種局部內(nèi)環(huán)境的改變可直接或間接導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡和壞死[5]。

1995年美國學(xué)者Crowe等[6]首次證實(shí)脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞存在凋亡現(xiàn)象。Li等[7]于1996年首次在大鼠SCI模型中發(fā)現(xiàn)存在大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因Bcl-2的表達(dá)，Bcl-2是調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性死亡的一個重要基因，Bax和Bcl-2具有同源性，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，Bcl-2/Bax對細(xì)胞的凋比值是決定細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）是參與調(diào)節(jié)和執(zhí)行凋亡最重要的蛋白酶之一，抑制其活性可以減少凋亡發(fā)生，在脊髓損傷中增加半胱氨酸蛋白酶的活性會導(dǎo)致神經(jīng)組織退化[8]。有研究[9]表明：神經(jīng)細(xì)胞凋亡是ASCI繼發(fā)性損傷的主要形式，也是脊髓損傷后功能恢復(fù)不良的主要原因。損傷段凋亡現(xiàn)象主要發(fā)生在傷后24h；相鄰節(jié)段凋亡高峰在72h，凋亡細(xì)胞絕對數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于原發(fā)損傷段[10]，因此，ASCI后72h是治療的關(guān)鍵時(shí)期。

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種生物活性較強(qiáng)的血管生成肽，通過特異性地結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子受體，高度特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)血管的生成和血管通透性等。VEGF在脊髓損傷過程具有神經(jīng)保護(hù)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生等作用[11]。

補(bǔ)陽還五湯由清代名醫(yī)王清任所創(chuàng)，始見于《醫(yī)林改錯》，由黃芪、赤芍、當(dāng)歸、地龍、川芎、桃仁和紅花組成，近年報(bào)道補(bǔ)陽還五湯在促進(jìn)損傷神經(jīng)再生修復(fù)等方面，有獨(dú)特的效果[12]。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后經(jīng)過一段時(shí)間補(bǔ)陽還五湯組與損傷對照組下肢功能均有恢復(fù)，補(bǔ)陽還五湯組較損傷對照組恢復(fù)更加明顯；脊髓損傷后導(dǎo)致Caspase-3p20和Bax的表達(dá)增加，Bcl-2、VEGF的表達(dá)減少，神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加；補(bǔ)陽還五湯可使Caspase-3p20和Bax的表達(dá)減少，Bcl-2、VEGF的表達(dá)增加，神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少。

綜上所述，補(bǔ)陽還五湯可能是通過增加VEGF的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，減少脊髓損傷部位的繼發(fā)性損傷，最終起到促進(jìn)運(yùn)動功能恢復(fù)的作用。實(shí)驗(yàn)表明補(bǔ)陽還五湯具有治療脊髓損傷的潛力，但具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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（收稿：2014-04-29 修回：2014-07-28）

Effects of Buyang Huanwu Decoction on Neural Cell Apoptosis after Acute Spinal Cord Injury in Rats

HOU Zhaoyang1，CHEN Zhe2，WEI Jiasen1.1 Second Clinical Collegeof Zhejiang ChineseMedical University,Hangzhou（310053）,China;2 Department of Spinal Surgery,Second Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou（310000）,China

Objective To determine the therapeutic efficacy of Buyang Huanwu Decoction（BYHWD）in the treatment of acute spinal cord injury（ASCI） in rats,and to investigate the underlying mechanism.MethodsThirty SD rats were randomized into control group（laminectomy only）,ASCI group,ASCI+BYHWD group,10 rats in each group.ASCI was induced by using the modified weight-drop method in the latter two groups.Rats in control and ASCI groups were intragastrically given distilled water once daily for 3d，rats in ASCI+BYHWD group were given BYHWD for the same period.Locomotors functional recovery was assessed on day 1，7，14 after operation by performing open-field locomotors tests（BBB score）.On postoperative day 14，the segments of spinal cord encompassing the injury site were removed for histopathological analysis.Immunohistochemistry was performed to observe the expression of B-cell CLL/lymphoma-2（Bcl-2），BCL-2-associated X protein（Bax），caspase-3，and vascular endothelial growth factor（VEGF）.ResultsBoth of the BYHWD-treated rats and ASCI rats had locomotor function recovery on postoperative day 7 and 14（P＜0.05），but the BYHWD-treated rats had significantly better locomotor function recovery than ASCI group did（D7：9.05±0.95 vs 5.75±1.97；D14：12.60±1.55 vs 8.80±3.34；all P＜0.05）.Compared with ASCI group，the BYHWD-treated rats had reduced expression of caspase-3（16.70±2.21 vs 20.30±4.13，P＜0.05）and Bax（18.29±2.21 vs 21.14±2.41，P＜0.05），increased expression of Bcl-2（10.57±0.97 vs 6.42±3.20，P＜0.05）and VEGF（11.75±1.03 vs 9.50±1.30，P＜0.05）.ConclusionBYHWD treatment after ASCI can significantly improve locomotor recovery by upregulating VEGF and inhibiting neural apoptosis.

rats;spinal cord injury；Buyang Huanwu Decoction；Apoptosis；VEGF

p

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2010ZB049）；浙江省教育廳科研項(xiàng)目（No.Y200906743）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院（杭州 310053）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院脊柱外科（杭州 310000）

陳哲，Tel：18958013615；E-mail：cz6851@sina.com