光譜法研究間尼索地平與人血清白蛋白的相互作用

任曉英，王 靜，馮翠麗，王 偉*，王清君，李志強(qiáng)

（1.河北省保定市第二醫(yī)院急診科，河北保定071051；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院無(wú)機(jī)物化教研室，河北石家莊050017；

3.河北省新河縣中醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北新河055650）

·論 著·

光譜法研究間尼索地平與人血清白蛋白的相互作用

任曉英1，王 靜2，馮翠麗3，王 偉2*，王清君2，李志強(qiáng)3

（1.河北省保定市第二醫(yī)院急診科，河北保定071051；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院無(wú)機(jī)物化教研室，河北石家莊050017；

3.河北省新河縣中醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北新河055650）

目的研究不同溫度下間尼索地平（m-nisoldipine，m-Nis）與人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）相互作用。方法采用紫外光譜法和熒光光譜法在模擬人體生理pH=7.4的0.1mol/L磷酸緩沖溶液中研究不同溫度下m-Nis與HSA相互作用的光譜行為。結(jié)果m-Nis沒(méi)有使HSA的構(gòu)象發(fā)生變化。293K、301K和310K時(shí)的猝滅常數(shù)為分別為1.03×105mol/L，1.25×105mol/L和1.31×105mol/L；結(jié)合點(diǎn)數(shù)n近似為1，反應(yīng)的焓變值為3.695kJ/mol，且ΔG＜0，ΔS＞0；m-Nis在HSA上的結(jié)合位置距色氨酸殘基的距離（r）=2.96nm。結(jié)論m-Nis對(duì)HSA的熒光猝滅作用不是簡(jiǎn)單的動(dòng)態(tài)猝滅或靜態(tài)猝滅，而是形成了1∶1的復(fù)合物，造成熒光猝滅；m-Nis與HSA之間發(fā)生的是非輻射能量轉(zhuǎn)移過(guò)程，二者之間的主要作用力是疏水力。

尼索地平；血清白蛋白；光譜法，熒光

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是人體血漿中含量最為豐富的大分子蛋白質(zhì)，大部分藥物的運(yùn)輸要通過(guò)與血液中的血清白蛋白的可逆結(jié)合才能完成［1-4］。間尼索地平（m-nisoldipine，m-Nis）是河北醫(yī)科大學(xué)自主合成的二氫吡啶類鈣離子抑制劑，與同類的二氫吡啶類藥物相比，更能有效地增強(qiáng)心臟輸血量，降低心肌收縮應(yīng)力，并在胸動(dòng)脈中有高的選擇性［5］。熒光光譜法是研究血清白蛋白與藥物相互作用的重要手段［6］。本文采用熒光光譜法，輔助紫外光譜，對(duì)m-Nis與HSA的作用機(jī)制進(jìn)行研究，計(jì)算得到m-Nis和HSA結(jié)合的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)，旨在為深入研究m-Nis在體內(nèi)的儲(chǔ)存、運(yùn)輸、作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥：LS50B型熒光光譜儀（美國(guó)Per Kin-Elmer公司）；HH-1型恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；UV-2201型紫外-分光光度計(jì)（日本島津儀器株式會(huì)社）；KQ-100DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；pHS-25型精密酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）；HSA（北京索來(lái)寶生物技術(shù)有限公司）；m-Nis（河北醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)教研室自制）；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配置

1.2.1.1 HSA溶液：精確稱量HSA適量，用pH= 7.40緩沖液溶解并配制成濃度為2.0×10-5mol/L的溶液于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 m-Nis溶液：精確稱量m-Nis適量，用少量無(wú)水乙醇溶解并配成濃度為2.0×10-3mol/L的儲(chǔ)備液。

1.2.2 紫外光譜和熒光光譜分析：分別在5mL的容量瓶中加入1.0mL HSA溶液，然后依次加入不同體積（0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.07mL）的m-Nis溶液，以pH=7.40的磷酸鹽緩沖液定容，水浴振搖30min，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為280nm，掃描范圍為280～500nm，掃描速度為100nm/min，激發(fā)與發(fā)射狹縫均為5nm。測(cè)定不同溫度下，HSA在不同濃度的m-Nis存在時(shí)的熒光光譜和同步熒光光譜（Δλ= 15nm，Δλ=60nm）；以緩沖鹽做參比，測(cè)定m-Nis與HSA濃度比為1∶1時(shí)的紫外吸收光譜。

2 結(jié) 果

2.1 m-Nis對(duì)HSA的熒光猝滅作用：m-Nis在與HSA結(jié)合的過(guò)程中能不同程度的猝滅HSA的熒光強(qiáng)度，且隨著溫度的升高猝滅強(qiáng)度增強(qiáng)，說(shuō)明m-Nis與HSA發(fā)生了相互作用。按實(shí)驗(yàn)方法得到HSA的熒光猝滅光譜見(jiàn)圖1。由圖可以看出，在不同溫度不同濃度下熒光強(qiáng)度F降低且峰位也發(fā)生了藍(lán)移。

2.2 m-Nis對(duì)HSA的猝滅常數(shù)的計(jì)算和猝滅機(jī)制的探討：熒光猝滅過(guò)程通常分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅2種［3］。動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程遵循Stern-Volmer方程［7］，對(duì)HSA與m-Nis的結(jié)合體系而言是指m-Nis與HSA的激發(fā)態(tài)分子之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移或是電子轉(zhuǎn)移。

圖1 293K時(shí)m-Nis對(duì)HSA發(fā)射光譜的影響曲線1～7濃度分別為0、0.4、0.8、1.2、1.6、20.0、2.8×10-5mol/LFigure1 Effectofm-Nison emission spectraofHSA（4.0×10-6mol/L）at293K withλex=280nmFrom curve 1 to 7m-Nis：0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.8×10-5mol/L

其中F0和F分別為加入m-Nis前后的熒光強(qiáng)度，Kq為雙分子猝滅過(guò)程的速率常數(shù)。τ0為無(wú)m-Nis時(shí)HSA的平均壽命，一般為10-8s［8］。Ksv稱之為Stern-Volmer猝滅常數(shù)，隨溫度的升高動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)會(huì)增大。而靜態(tài)猝滅過(guò)程遵循以下方程。

其中Ks是靜態(tài)猝滅常數(shù)，其隨溫度的升高而減小。由猝滅常數(shù)隨溫度的變化規(guī)律可判斷熒光猝滅類型。293K、301K和310K時(shí)m-Nis對(duì)HSA猝滅過(guò)程的Ksv，Kq和相應(yīng)的Stern-Volmer方程列于表1。隨著溫度的升高，猝滅常數(shù)Ksv、Kq有輕微的增大，不符合靜態(tài)猝滅的機(jī)制。但從m-Nis對(duì)HSA的猝滅常數(shù)數(shù)量級(jí)在1013上推斷也不是典型的動(dòng)態(tài)猝滅，因?yàn)殁鐒?duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)為2× 1010。所以，僅由以上數(shù)據(jù)不能判斷猝滅類型。

表1 不同溫度下m-Nis與HSA作用的Stern-Volmer猝滅常數(shù)Table 1 Stern-Volmer quenching constants for m-Nis-HSA system s at different temperature

為進(jìn)一步驗(yàn)證m-Nis對(duì)HSA熒光的猝滅機(jī)制，測(cè)定了m-Nis與HSA相互作用的紫外吸收光譜圖，見(jiàn)圖2，3。HSA在紫外光譜區(qū)有2個(gè)特征的蛋白質(zhì)吸收帶，隨著m-Nis的不斷加入，波長(zhǎng)為280nm的吸收帶表現(xiàn)為明顯的增色效應(yīng)且吸收峰位置基本不變。中HSA和等濃度m-Nis的吸光度相加所得圖譜及m-Nis與HSA等摩爾混合物的吸收光譜圖幾乎完全重合，表明HSA的紫外吸收光譜沒(méi)受m-Nis的影響，說(shuō)明m-Nis對(duì)HSA的熒光猝滅過(guò)程沒(méi)有生成不發(fā)光的配合物，也不是典型的靜態(tài)猝滅［9］。

2.3 m-Nis對(duì)HSA構(gòu)象的影響以及二者結(jié)合距離的計(jì)算：在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，HSA的濃度固定為4×10-6mol/L，在m-Nis的濃度逐漸增加的條件下，固定Δλ分別為15nm和60nm進(jìn)行熒光掃描，得到HSA中酪氨酸和色氨酸殘基的同步熒光光譜，見(jiàn)圖4。表明隨m-Nis濃度的增大，二者的同步熒光強(qiáng)度逐漸降低，峰位和峰形基本沒(méi)變，說(shuō)明m-Nis同時(shí)對(duì)HSA的色氨酸和酪氨酸殘基發(fā)生作用，且m-Nis的加入沒(méi)有改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象。

能量轉(zhuǎn)移效率E與結(jié)合距離r之間的關(guān)系式如下［1］。

其中，R0為能量轉(zhuǎn)移效率為50％時(shí)的臨界距離；ΦD為HSA的熒光量子產(chǎn)率，通常取值0.15；K2為偶極空間取向因子，可取HSA與m-Nis各向隨機(jī)分布的平均值2/3；n為介質(zhì)的折射指數(shù)，一般取值1.366；F（λ）為HSA在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度；ε（λ）為m-Nis在波長(zhǎng)λ處的摩爾吸光系數(shù)；Δλ為計(jì)算時(shí)分割的波長(zhǎng)跨度；J是HSA的熒光發(fā)射光譜和m-Nis的紫外吸收光譜之間的重疊積分。HSA的熒光光譜與m-Nis的吸收光譜的重疊圖見(jiàn)圖5。結(jié)合公式（3）、（4）、（5）計(jì)算得到J=1.087×10-14cm3·L-1·mol-1，E=0.29，r=2.96nm。由于m-Nis在HSA上的結(jié)合位置距色氨酸殘基的距離r＜7nm，根據(jù)Foster's偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論可以得出結(jié)論，m-Nis與HSA之間發(fā)生的是非輻射能量轉(zhuǎn)移過(guò)程。

圖2 HSA在m-Nis存在時(shí)的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖曲線1～6 m-Nis濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.8×10-5mol/LFigure 2 UV-vis absorption spectra of HSA（4.0×10-6mol/L）in the presence ofm-NisFrom curve 1 to6 Cm-Nis：0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.8×10-5mol/L

圖4 m-Nis和HSA的同步熒光光譜曲線1～7 HSA濃度為4.0×10-6mol/L，m-Nis濃度分別為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.8×10-5mol/LFigure 4 Synchronous fluorescence spectra ofm-Nis and HSA systemCHSA=4.0×10-6mol/L，from curve 1 to 7 Cm-Nis：0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.8×10-5mol/L

圖5 HSA的熒光光譜與m-Nis的紫外光譜的重疊圖Figure 5 Overlapping between the fluorescence spectrum of HSA and UV spectrum ofm-Nis

2.4 m-Nis對(duì)HSA結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的確定：采用Scatchard方程［10］計(jì)算了m-Nis與HSA相互作用的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，見(jiàn)表2。不同溫度下的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n都接近于1，表明m-Nis與HSA形成了1∶1的復(fù)合物。利用修正的Stern-Volmer方程求得結(jié)合常數(shù)K，見(jiàn)表3。結(jié)合常數(shù)K的數(shù)量級(jí)在104～105左右，表明m-Nis與HSA形成瞬時(shí)的激發(fā)態(tài)復(fù)合物的作用很強(qiáng)，m-Nis完全能憑借這種結(jié)合作用被血液中的血清白蛋白儲(chǔ)存和運(yùn)輸。2.5 m-Nis與HSA結(jié)合過(guò)程的熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算和作用力類型分析：蛋白質(zhì)等生物大分子和有機(jī)小分子之間的結(jié)合力主要有疏水作用力、靜電引力、氫鍵、范德華力等。根據(jù)熱力學(xué)公式，與△G=△HT△S=-RT/nK求得各熱力學(xué)參數(shù)，見(jiàn)表4。Ross根據(jù)反應(yīng)前后焓變△H和熵變△S的大小總結(jié)出如下規(guī)律［11］，如△1t＞0、△S＞0時(shí)，分子間為疏水作用力。由此可見(jiàn)m-Nis與HSA之間的作用力主要為疏水作用力。

表2 不同溫度下m-Nis與HSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Table 2 Binding sites ofm-Nisw ith HSA at different tem peratures

表3 不同溫度下m-Nis與HSA的結(jié)合常數(shù)Table 3 Binding constants ofm-Nis w ith HSA at different temperatures

表4 m-Nis與HSA結(jié)合過(guò)程的熱力學(xué)參數(shù)Table 4 Thermodynam ic parameters for binding ofm-Nis with HSA

3 討 論

本文在分子水平上，利用熒光光譜法和紫外分光光度法詳細(xì)地研究了在模擬的生理?xiàng)l件下m-Nis與HSA之間的相互作用。根據(jù)熒光猝滅常數(shù)隨溫度的變化趨勢(shì)初步判斷兩者的猝滅過(guò)程為動(dòng)態(tài)猝滅，但是其數(shù)量級(jí)大于最大猝滅常數(shù)，用動(dòng)態(tài)猝滅機(jī)理無(wú)法解釋清楚。而紫外數(shù)據(jù)表明了藥物沒(méi)有直接與HSA形成基態(tài)復(fù)合物，也不符合靜態(tài)機(jī)制。熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算表明兩者的作用是一個(gè)熵加和Gibbs自由能降低的自發(fā)過(guò)程，反應(yīng)伴隨吸熱過(guò)程，所以隨溫度的升高，猝滅常數(shù)也增大。藥物與HSA之間的作用力為疏水力。由于m-Nis與HSA的結(jié)合距離較小，藥物很可能是在疏水作用力的引導(dǎo)下，嵌入色氨酸或是酪氨酸附近的疏水腔，微小程度地改變了蛋白質(zhì)的微環(huán)境，使得蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度降低，熒光峰位發(fā)生了微小的藍(lán)移。

綜上所述，m-Nis與HSA的相互作用機(jī)制并不

是簡(jiǎn)單的動(dòng)態(tài)猝滅或靜態(tài)猝滅，而是形成一種復(fù)合物，其由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)并未伴隨熒光發(fā)射［12］，而是發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移過(guò)程。m-Nis沒(méi)有使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，僅通過(guò)蛋白質(zhì)的運(yùn)輸?shù)竭_(dá)作用部位，并得到相應(yīng)的靶點(diǎn)，發(fā)揮藥理作用。

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（本文編輯：劉斯靜）

INTERACTIONS BETWEEN M-NISOLDIPINE AND HUMAN SERUM ALBUM IN BY SPECTROSCOPIC METHOD

REN Xiaoying1，WANG Jing2，F(xiàn)ENG Cuili3，WANGWei2*，WANG Qingjun2，LIZhiqiang3
（1.Department of Emergency，the Second Hospital of Baoding City，Hebei Province，Baoding 071051，China；
2.Department of Inorganic and Physical Chemistry，the School of Pharmaceutical Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China；3.Department of Gynaecology and Obstertrics，Chinese Traditional Medicine Hospital of Xinhe County，Hebei Province，Xinhe055650，China）

Objective To study the interactions between m-nisoldipine（m-Nis）and human serum albumin（HSA）.MethodsUltraviolet visible spectroscopy（UV-vis）and fluorescence spectroscopy were used to study the spectral behavior of interactions between m-Nis and HSA under different temperature at the physiological pH（7.4）.Resultsm-Nis did not cause the conformation change of the HAS；The quenching constants at 293K，301K，and 310K were 1.03×105mol/L，1.25× 105mol/L，1.31×105mol/L，respectively；the number of binding sites（n）was nearly 1.The enthalpy change（ΔH）was 3.695 kJ/mol withΔG＜0 andΔS＞0；The distance between binding site and tryptophan（r）=2.96nm.

Themechanism of fluorescence quenching ofm-Nis to HSA was neither static nor dynamic fluorescence quenching，but formed 1∶1 complex and resulted fluorescence quenching.The non-radialization energy transfer process occurred betwwenm-Nis and HASand the action force was hydrophobic interaction.

nisoldipine；serum albumin；spectrometry，fluorescence

R657.39

A

1007-3205（2013）06-0678-05

2012-10-25；

2012-12-03

2009年河北省教育廳資助項(xiàng)目（2009148）；2009年河北省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目（20090059）；河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（09276438）

任曉英（1973-），女，河北保定人，保定市第二醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事急診科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：hbydwangwei@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.06.021