青藤堿微乳的制備及在大鼠體腸吸收的研究

余曉娜 呂耿彬 張 艷

（1廣東省中醫(yī)院藥學部，廣州510120；2廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣州510006）

青藤堿微乳的制備及在大鼠體腸吸收的研究

余曉娜1呂耿彬2張 艷2

（1廣東省中醫(yī)院藥學部，廣州510120；2廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣州510006）

目的 制備青藤堿微乳，并對青藤堿微乳及其普通混懸劑在體腸吸收特性進行對比。方法 以油酸、吐溫80、無水乙醇分別為油相、乳化劑和助乳化劑制備青藤堿微乳。利用大鼠在體腸循環(huán)模型，采用HPLC法測定青藤堿微乳及其普通混懸劑在體腸吸收回流液中青藤堿的濃度。結(jié)果 青藤堿微乳組在大鼠小腸段的吸收明顯高于普通青藤堿混懸液組。結(jié)論 微乳制劑對青藤堿在大鼠小腸內(nèi)吸收有明顯的促進作用。

青藤堿；微乳；在體腸吸收

青藤堿為中藥青風藤中主要有效成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗風濕及免疫抑制等作用，臨床用于治療RA等自身免疫性疾病。但青藤堿在口服后，存在生物半衰期較短、生物利用度低、胃腸道刺激性缺點［1］。微乳（microemulsion）一種由油相、表面活性劑、助表面活性劑以及水相分散自發(fā)形成的各向同性、熱力學性質(zhì)穩(wěn)定的體系，其粒徑大小一般為10～100nm［2］。作為新型載藥系統(tǒng)，微乳具有提高藥物溶解度和藥物生物利用度，制備簡便等優(yōu)點［3］。本實驗前期已制備一種由油酸、吐溫80、無水乙醇所組成穩(wěn)定的青藤堿微乳，以下將對其質(zhì)量進行評價，并利用大鼠在體腸吸收實驗，探討口服微乳制劑對青藤堿的腸吸收是否具有促進作用。

1 材料儀器

1.1 藥品與試劑 青藤堿對照品（購自四川維克奇生物科技有限公司，批號：110708）；青藤堿原料藥（實驗室自制）；甲醇（色譜純，迪馬公司）；水為超純水，其他試劑為分析純。

1.2 儀器 T01-101電子蠕動泵；Waters高效液相色譜儀（515泵，2487紫外檢測器），美國Waters公司；N3000色譜工作站，浙江大學；AUW120D十萬分之一分析天平，日本島津；JB-3型磁力攪拌器。

1.3 實驗動物 健康雄性SD大鼠，體重180～220g（廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，實驗動物生許可證號：SCXK（粵）2008-0020，粵監(jiān)證字2008A002。

2 方法與結(jié)果

2.1 試液的配制

2.1.1 空白腸營養(yǎng)液的配制 空白腸營養(yǎng)液（K-R液）：稱取NaCL7.8g，KCL0.35g，NaHCO31.37g，NaH2PO40.32g，MgCL20.02g，葡萄糖1.4g，加蒸餾水使成1000mL。

2.1.2 青藤堿微乳及其腸循環(huán)液的制備 將青藤堿提取物加入到混勻的處方量油相、吐溫80以及無水乙醇中，并使提物充分溶解，將混合溶液置于磁力攪拌器上，調(diào)節(jié)溫度（25±0.5）℃以及合適的轉(zhuǎn)速，逐滴加入水相，攪勻得金黃色澄清透明載青風藤微乳溶液（5mg／g）。精密稱取青藤堿微乳1g置于100mL容量瓶中，加入空白腸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得含青藤堿50mg／L的腸循環(huán)供試液。

2.1.3 青藤堿混懸液的制備 精密稱取青藤堿5mg加入100ml含有0.5%的羧甲基纖維素鈉K-R液中，磁力攪拌器攪勻并超聲使青藤堿充分溶解，得到50mg／L的青藤堿混懸液。

2.2 腸循環(huán)液中青藤堿含量測定的方法

2.2.1 色譜條件 Waters高效液相色譜儀；色譜柱為AgilentTC-C18ODS柱（5μm，250mm x4.6mm）；Phenomenex保護柱；流動相：甲醇-水（體積比為55∶45），水中加入0.2%的三乙胺；流速1mL／min，檢測波長為265nm。分別取對照品、空白K-R液、對照品+空白KR液在該色譜條件下測定，青藤堿的出峰時間8.6min，分離度較好，且空白無干擾，色譜圖見圖1。

圖1 青藤堿HPLC色譜圖

2.2.2 標準曲線的制備 精密稱取青藤堿12mg，置于10mL的量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，振搖即得濃度為1.2mg／mL的青藤堿對照品貯備液。分別對標準品貯備液進行倍比稀釋，得到青藤堿濃度為12、24、48、96、192、384、768μg／mL對照品溶液。按2.2.1項下方法，均進樣10μL。以峰面積（Y）對標準品濃度（X）進行線性回歸，分別得回歸方程Y＝1596.8X+4033.1，r＝0.9999。結(jié)果表明青藤堿在12～792μg／mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗 將上述12μg／mL青藤堿對照品溶液于冷藏（0～4℃）、避光條件下儲存，1d內(nèi)重復測定三次，計算日內(nèi)精密度；隔天測定一次，連續(xù)測定三次，計算日間精密度。結(jié)果日內(nèi)精密度為1.09%，日間精密度為1.69%，說明儀器精密度良好。

2.2.4 回收率試驗 精密量取青藤堿對照品貯備液至容量瓶中，加入K-R液稀釋成含青藤堿24.0、48.0、96.0μg／mL的溶液，并按2.2.2項下進樣10μl，測定其峰面積，平均回收率為99.77%，RSD為1.03%，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果（%）

2.2.5 青藤堿在空白K-R液中的穩(wěn)定性考察 用空白K-R液配含青藤堿濃度為100.0μg／mL的溶液，置37℃水浴鍋中，分別于0、1、2、4、6、8、10h取樣，并用0.45μm的微孔濾膜過濾溶液，測定溶液中的青藤堿含量。結(jié)果表明青藤堿含量在10h內(nèi)未發(fā)生明顯變化，表明青藤堿穩(wěn)定性較好，見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（青藤堿）（%）

2.3 大鼠在體腸吸收實驗 大鼠在體腸循環(huán)實驗方法［4-7］：為消除實驗過程中管路對藥物的吸附作用，于實驗前必須先將管道進行藥物飽和處理，在實驗開始前用供試液反復沖洗實驗管道，直至出液口藥液濃度與供試液濃度相等。取禁食不禁水24h的SD大鼠，稱重，腹腔注射20%烏拉坦（0.6mL／100g）進行麻醉，置于手術(shù)臺上固定并用恒溫加熱墊保持動物并保體溫。沿腹中線打開3～4cm，在十二指腸上端和回腸下端各切一個小口，在十二指腸上端以及回腸下端插入硅膠管并用手術(shù)線扎緊，將保溫至37℃的生理鹽水以5mL·min-1流速沖凈小腸內(nèi)容物，最后用空氣排凈生理鹽水，在腹部傷口處用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋保濕。

取已配置保溫至37℃青藤堿微乳K-R溶液和青藤堿混懸液以5mL·min-1平衡10min后，取樣2mL作為0h的樣品，然后以2.5mL／min恒速循環(huán)。以改變流速時為0時，以后分別在15、30、60、90、120、150min取樣2mL，每次取樣后立即補加恒溫的K-R氏液2mL。在循環(huán)回路中用一50mL量筒盛裝含藥循環(huán)液，每到取樣時間點讀取液體體積，待循環(huán)完畢，用空氣排盡腸內(nèi)和管路內(nèi)液體，即為腸道和管路的死體積。死體積加上每一時間點的量筒讀數(shù)即為該時間點循環(huán)液體積。按下式計算：t（h）累積吸收率（%）＝（0時剩余藥量-t時剩余藥量）／0時剩余藥量x100%。

2.4 在體腸吸收實驗結(jié)果 將青藤堿微乳和青藤堿混懸液各個時間段的樣品用0.45μm的微孔濾膜過濾溶液，按“2.2.1”項方法進樣10μL測定峰面積。由結(jié)果可知，在150min內(nèi)，青藤堿微乳組在大鼠小腸段腸吸收累積吸收率明顯高于混懸液組，兩組具有顯著性差異（P＜0.05），表明青藤堿制備成微乳后，能明顯提高其在小腸段的吸收，提高生物利用度。見表3和圖2。

表3 青藤堿微乳和青藤堿混懸液腸吸收累積吸收率 （n＝5，%）

圖2 青藤堿微乳與其混懸液的腸吸收圖

3 討論

青藤堿在口服后存在半衰期短、生物利用度低、有胃腸道刺激性、且經(jīng)體循環(huán)后到達病變部位藥量少等缺點［7］，學者一直致力于提高青藤堿口服后的生物利用度，減輕其不良反應，其中制備微乳是通過改變劑型來解決這些問題的方法。微乳是一種表面張力較低的藥物載體，由于其特殊結(jié)構(gòu)，易于透過細胞壁的水化層，可使藥物和胃腸的上皮細胞充分接觸，促進藥物在小腸的吸收，提高藥物的生物利用度。

通過青藤堿微乳與其混懸液的腸吸收情況進行比較，發(fā)現(xiàn)青藤堿微乳組各個時間段在體腸吸收均優(yōu)于混懸液組，且累計吸收的增幅明顯高于混懸液組，說明微乳劑型可有效促進青藤堿在大鼠小腸部位的吸收。這可能是微乳的粒徑小，在腸道內(nèi)易于通過胃腸道的水化層，同時微乳的黏附性較好，可以延長藥物與腸黏膜上皮細胞的接觸時間，可以促進藥物在胃腸道的吸收，但其具體的機制還需要通過更多的實驗證明。

［1］李樂，張彩玲，宋必衛(wèi)．青藤堿的藥理研究與臨床應用［J］．中藥新藥與臨床藥理，2006，7（14）：312．

［2］Huabing Chen，Xueling Chang，Ting Weng，et al．A study of microemulsion systems for transdermal delivery of triptolide［J］．Journal of Controlled Release，2004，9（8）：428．

［3］M．J．Lawrence，G．D．Rees．Microemulsion-based media as novel drug delivery systems［J］．Adv．Drug Deliv．Rev，2000，4（5）：90．

［4］王利勝，涂星，陳豆，等．在體腸循環(huán)法研究黃芪提取物對川芎嗪大鼠腸吸收的影響［J］．中國醫(yī)院藥學雜志，2012，32（9）：661-664．

［5］涂星，王利勝，陳豆．在體腸循環(huán)法研究川芎嗪自微乳的大鼠腸吸收［J］．中國醫(yī)藥指南，2012，10（9）：2．

［6］李紅磊，張忠義，馬蕾蕾，等．丹參酮微乳的制備及大鼠在體腸吸收［J］．中國中藥雜志，2007，32（11）：1206．

［7］周莉玲，李銳，周華，等．青藤堿制劑藥動學試驗中藥物累積法與血藥濃度相關(guān)性研究［J］．中成藥，1996，18（9）：1761．

Preparation of Sinomenine Microemulsion and Its Absorption in Rat Intestine

Yu Xiaona1Lu Gengbin2Zhang Yan2
(1 Guangdong Province Hospital of Chinese medicine,Guangzhou 510120,China; 2 College of Chinese Traditional medicine,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006'China)

ObjectiveTo prepare the microemulsion of sinomenine，and to compare the absorption kinetics of sinomenine microemulsion with sinomenine powder at small intestine of rats．MethodsThe sinomenine microemulsion formulations were prepared using oleic acid as anoil，Tween 80 as a surfactant and ethyl alcohol as a cosurfactant．Using rat’s in vivo intestinal circulation experiment and HPLC to investigate the concentration of sinomenine in the perfusate．ResultsThe accumulative absorption rate of sinomenine microemulsion was significantly improved compared with sinomenine powder．ConclusionThe sinomenine microemulsion significantly improved the absorption of sinomenine in intestinal of rats．

Sinomenine；Microemulsified；In situ Intestinal Absorption

10.3969／j.issn.1672-2779.2013.14.102

1672-2779（2013）-14-0155-02

楊 佳

2013-05-10）