兩種中藥復(fù)方對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織Glu含量及NMDA受體亞單位NR1表達(dá)的影響

王業(yè)梅 胡建鵬 程惠娟

安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038

兩種中藥復(fù)方對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織Glu含量及NMDA受體亞單位NR1表達(dá)的影響

王業(yè)梅 胡建鵬 程惠娟

安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038

目的：比較益氣活血湯、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯和星蔞承氣湯3種中藥復(fù)方對(duì)急性腦缺血再灌注大鼠缺血腦組織Glu含量與NR1表達(dá)的影響。方法：采用線(xiàn)栓法阻斷大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈制作局灶性腦缺血再灌注模型。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯和星蔞承氣湯組。采用高效液相色譜法和免疫組化SABC染色法，分別檢測(cè)Glu的含量和NR1表達(dá)。結(jié)果：腦缺血2h再灌注各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組比較，模型組Glu含量和NR1表達(dá)均顯著升高和增加（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，各治療組各時(shí)間點(diǎn)Glu含量和NR1表達(dá)顯著降低和減少（P＜0.01）；治療組組間比較，48h無(wú)顯著差異，6h星蔞承氣湯組在減少NR1表達(dá)方面最優(yōu)（P＜0.05）；結(jié)論：兩種中藥復(fù)方可以通過(guò)降低Glu含量和減少NR1表達(dá)，減輕興奮性氨基酸毒性，抗腦缺血再灌注損傷。

腦缺血再灌注；鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯；星蔞承氣湯；谷氨酸；N－甲基－D－天冬氨酸受體

腦卒中在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中又稱(chēng)腦血管疾病或腦血管意外，為高發(fā)病率、死亡率、致殘率和復(fù)發(fā)率疾病，是危害人類(lèi)健康的重大疾病之一，死亡率高于心血管疾病及癌癥［1］，其中，缺血性腦卒中最為多見(jiàn)，故研究其治療藥物具有重要臨床價(jià)值。腦缺血缺氧后，神經(jīng)元釋放大量以谷氨酸（glutamate，Glu）為代表的興奮性氨基酸（excitatory amino acids，EAA）通過(guò)激活其N(xiāo)－甲基－D－天冬氨酸（N－methyl－D－aspartate，NMDA）受體（NR1是其主要功能亞單位）而引起神經(jīng)元的缺血缺氧性損傷［2］。潛陽(yáng)熄風(fēng)、化痰通腑為缺血性中風(fēng)急性期臨床常見(jiàn)治法［1］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀(guān)察上述兩種治法的代表中藥方劑對(duì)腦缺血再灌注大鼠缺血腦組織Glu含量及NR1表達(dá)的影響，以探討其抗腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制，為兩種中醫(yī)治法的臨床合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，豐富與發(fā)展中醫(yī)腦病理論。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 健康Wistar雄性大鼠96只，體質(zhì)量280 ±20g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 （合格證號(hào)：SCXK－5100104）。將動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯和星蔞承氣湯4組。每組24只，分缺血2h后再灌注6h、48h、72h三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各8只（其中4只用于Glu含量的檢測(cè)，4只用于NR1表達(dá)的檢測(cè)）。

1.2 藥物與試劑 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組：選用鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯，由懷牛膝30g、生代赭石30g、生牡蠣15g等組成。星蔞承氣湯組：選用星蔞承氣湯，由全栝蔞30g、膽南星10g、生大黃10g等組成。全部藥物由安徽中醫(yī)學(xué)院中藥制劑中心制備，相當(dāng)于原生藥6.0g/mL，NR1單克隆抗體、二抗試劑盒、DAB、APES由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 局灶性腦缺血再灌注模型的制備 參考Longa［3］大腦中動(dòng)脈阻塞 （MCAO）改良制作局灶性腦缺血再灌注動(dòng)物模型。

1.4 給藥方法與標(biāo)本采集造模成功的大鼠按組分別給藥，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯20.3g/kg、星蔞承氣湯7g/kg的劑量每日上午及下午各給藥1次。假手術(shù)組、模型組按同樣方法予以等量生理鹽水灌胃。在再灌注各個(gè)相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)麻醉動(dòng)物（0.36ml/100g體重），一部分快速斷頭取腦，液氮保存，而后置于－700C超低溫冰箱，用于Glu含量的檢測(cè)；另一部分迅速開(kāi)胸暴露心臟，于右心耳部剪一小口，從左心室

插入導(dǎo)管至主動(dòng)脈，用200ml肝素化生理鹽水快速?zèng)_洗，至右心房流出液變清亮，隨后用4%多聚甲醛磷酸緩沖液（4oC，PH7.4）灌注約30min，灌注后立即取腦，放入4%多聚甲醛磷酸緩沖液中保存，用于檢測(cè)的NR1表達(dá)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)方法 自視交叉后切取缺血側(cè)額頂葉皮質(zhì)200mg，稱(chēng)重，加4%的磺基水楊酸8ml研磨。10000r/min離心機(jī)離心10min，離心后吸取上清液應(yīng)用高效液相法測(cè)Glu含量。NR1檢測(cè)采用免疫組化SABC染色法，采用Nikon ECLIPSE E600全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)，在相同的視野下，分別對(duì)相鄰切片的NR1免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)均用“X±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，所有統(tǒng)計(jì)由SPSS 11.0軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 兩種中藥復(fù)方對(duì)腦缺血再灌注大鼠不同時(shí)間腦組織Glu含量的影響（表1）

與假手術(shù)組比較，缺血再灌注6h、48h、72h，模型組Glu含量顯著升高（P＜0.01）；各治療組與同時(shí)段的模型組比較均有顯著降低（P＜0.05）；2用藥組組間比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間Glu含量的比較（±s）

表1 各組大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間Glu含量的比較（±s）

與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05；

9 4.54±1.31 3.84±1.11 4.24±1.25模型組 9 6.92±1.39**5.87±1.20**5.66±1.09**鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯 9 5.55±1.34△3.98±1.38△ 4.88±1.27△星蔞承氣湯 9 4.64±1.29△4.70±1.19△ 4.90±1.17 n 6 h 48h 72h假手術(shù)組組別△

2.2 兩種中藥復(fù)方對(duì)腦缺血再灌注大鼠不同時(shí)間NR1表達(dá)的影響（表2，圖1）

與假手術(shù)組比較，缺血再灌注6h、48h、72h，模型組NR1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著升高（P＜0.01）；各治療組與同時(shí)段的模型組比較均有顯著降低（P＜0.05）；2用藥組組間比較，缺血再灌注6h，星蔞承氣湯最優(yōu)（P＜0.05）；

表2 各組大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間NR1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比較（±s）

表2 各組大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間NR1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05；與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組比較▲P＜0.05；

6 55.13±21.92 60.30±24.45 58.36±21.60模型組 6 126.30±17.60*155.21±43.79*115.21±29.32*鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯 6 91.37±33.01△81.37±25.01△82.69±42.37△星蔞承氣湯 6 66.86±21.36△▲72.86±17.47△71.26±34.30 n 6 h 48h 72h假手術(shù)組組別△

3 討論

大量實(shí)驗(yàn)表明，興奮性毒性是造成缺血再灌注后腦損傷的主要原因之一［4］。興奮性氨基酸是主要包括Glu、天門(mén)氨酸（aspartate，Asp）等，EAA在腦內(nèi)的含量極高，尤其是Glu。興奮性氨基酸受體分為代謝型受體和離子型受體，NMDA受體屬于離子型受體的一類(lèi)。NR屬于NMDA受體家族，其中NR1是該受體的主要功能單位，它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布。研究表明NR在多種神經(jīng)興奮毒性過(guò)程中起關(guān)鍵作用［5］，腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元死亡主要是由Glu大量釋放作用其N(xiāo)MDA受體 （主要是NR1）引起的興奮毒性作用所致［6－7］。王英等［8］研究表明腦缺血后NMDA受體表達(dá)對(duì)EAA的釋放起正性調(diào)節(jié)作用，即缺血后Glu釋放激活NMDA受體表達(dá)，而NMDA受體表達(dá)的增加又促使Glu釋放，在腦缺血再灌注12h、24h、48h后均顯示了這一特點(diǎn)。李凈等［9］研究表明腦缺血2h再灌注6h NMDA受體蛋白表達(dá)就增加，至72h逐漸降低。我們的研究結(jié)果與報(bào)道的有所差別，但基本一致。

缺血性中風(fēng)因其臨床病證表現(xiàn)復(fù)雜多樣，臨床上出現(xiàn)了很多不同的理法方藥。近年來(lái)出現(xiàn)很多治療方法如解毒通絡(luò)法、補(bǔ)腎活血、化痰祛瘀、利水通降法等，雖取得了一定治療效果，并在一定層次上闡明了方藥的作用機(jī)制，但依然有局限性［10－11］。鎮(zhèn)肝息風(fēng)、化痰通腑法是臨床治療缺血性中風(fēng)的常見(jiàn)治法，故我們的實(shí)驗(yàn)選用這兩種方法。我們的研究表明，模型組缺血腦組織中Glu的含量和NR1表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，說(shuō)明Glu的興奮性毒性作用參與了腦缺血的病理生理過(guò)程。治療組與模型組比較，不同時(shí)間位點(diǎn)缺血腦組織中Glu含量和NR1表達(dá)顯著降低，提示腦缺血后應(yīng)用兩種中藥復(fù)方在不同的時(shí)間位點(diǎn)均可降低或減少缺血腦組織中Glu的含量和NR1表達(dá)，發(fā)揮腦保護(hù)作用。治療組組間比較6h以星蔞承氣湯組為佳，而其他時(shí)間點(diǎn)則無(wú)明顯差別。這說(shuō)明了兩種中藥復(fù)方可能存在著不同的作用時(shí)期及作用途徑。其原因是腦缺血后興奮性毒性引起的損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)的復(fù)雜性，是多環(huán)節(jié)多因素參與的結(jié)果，兩種中藥復(fù)方可能作用于級(jí)聯(lián)反應(yīng)不同的一個(gè)或多個(gè)環(huán)節(jié)或因素；另外，兩種中藥復(fù)方成分不同，其作用時(shí)期及作用途徑必然不同，確切的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Comparative Study on Effects of Two Traditional Chinese Medicinal Compounds on Content of Glutamate and Expressions of NR1 in Cerebral Tissue of Rats after Focal Cerebral Ischemia and Reperfusion

WANG ye－mei，HU jian－peng，CHENG huijuan
Anhui College of Traditional Chinese Medicine，Hefei，230038

Objective：To compare the effects of two traditional Chinese medicinal compounds on content of glutamate and expressions of NR1 in cerebral tissue of rats after focal cerebral ischemia and reperfusion（I/R）.Methods：The local cerebral I/Rmodel was established by ligation of the middle cerebral arteries（MCA）.The animals were divided into the sham－operative group，the model group，the Zhengan Xifeng Decoction（ZXD）group and the Xinglou Chengqi Decoction（XCD）group.The contents of glutamate was detected by HPLC.Im－munohistochemical SABC method was used to obsevre the expressions of NR1.Relusts：Compared with those of the sham－operative group，the contents of glutamate and expressions of NR1 increased markedly at all time pionts after I/R in model group.Compared with those of model group，the contents of glutamate and expressions of NR1 decreased or reduced at all time pionts after I/R in all treatment groups.The optimal effects were shown in XCD at6 h in reducing expressions of NR1.Conclusion：The two traditional Chinese medicinal compounds could reduce pathologic injury after focal cerebral I/R by decreasing or reducing contents of glutamate and expressions of NR1.

cerebral ischemia and reperfusion；Zhengan Xifeng Decoction；Xinglou Chengqi Decoction；glutamate；N－methyl－D－aspartate receptor

285.5

A

1007－8517（2013）12－0033－02

2013.4.6）

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81173629）；安徽省自然科學(xué)基金課題（1208085QH150）

王業(yè)梅（1977－），女，講師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究Tel：（0551）5169206