酚／氯仿法和鹽析法提取人類外周血基因組DNA方法的比較

宋潔云，劉芳宏，馬 軍，陳遠帆，王海俊

（北京大學(xué)兒童青少年衛(wèi)生研究所，北京 100191）

近年來，基因組關(guān)聯(lián)分析及后續(xù)的驗證研究在疾病遺傳病因探討方面取得越來越多的成果，在人群中開展大規(guī)模的分子遺傳學(xué)研究已經(jīng)成為一個重要的研究方向。因此從外周血樣本中提取高純度和產(chǎn)量的基因組DNA對于疾病遺傳病因的研究非常必要。酚／氯仿法和鹽析法均是目前提取外周血基因組DNA的方法［1］。酚／氯仿抽提方法可以較好地去除蛋白質(zhì)和色素物質(zhì)，多項研究均表明通過經(jīng)典或改良酚／氯仿法都能獲得高純度的 DNA［2－4］，但使用有機溶劑提取大量樣本的過程可能對操作人員身體造成危害。而鹽析法不需要使用有毒的有機溶劑，費用低廉，也有研究證實鹽析法獲取的DNA可以滿足PCR擴增的要求［5，6］，但鹽析法獲取的DNA純度能否滿足后續(xù)的分子生物學(xué)實驗的要求尚不明確。本研究比較兩種方法提取的DNA的純度、產(chǎn)量及后續(xù)實驗效果。

1 材料與方法

1.1 材料 80份－20℃保存的靜脈血凝塊（2－3 ml），分為酚／氯仿和鹽析法兩組進行DNA提取。所用試劑包括：4%CTAB，3×MLB溶液（24 m M Tris－Cl p H＝8.0，24 m M EDTA p H＝8.0，240 m M NaCl，4.8%SDS，0.048 mg／ml蛋白酶 K，二硫蘇糖醇1.44 mg／ml），TE （10 m M Tris－Cl，1m M EDTA，p H＝8.0），SE（25 m M EDTA，75 m M NaCl），5M NaCl，Tris－飽和酚，氯仿，異丙醇，無水乙醇，超純水。所有試劑均為分析純，購自北京鼎國生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

1.2.1.1 酚／氯仿法［7］

（1）將血凝塊樣本解凍后，搗碎至無明顯大塊血凝塊，加水至12 ml，充分混勻，3 000 r／min離心10 min，棄上清；

（2）沉淀中加入2 ml CTAB，搗碎沉淀，血凝塊碎片小于上一步驟，加水至12 ml，充分混勻，3 000 r／min離心10 min，棄上清；重復(fù)該步驟；

（3）沉淀中加入少量水，搗碎沉淀，加水至10 ml，3 000 r／min離心10 min，棄上清并晾干沉淀，加入0.5 ml 3×MLB溶液，37℃水浴過夜消化；

（4）轉(zhuǎn)移液體到EP管，加入0.5 ml酚／氯仿／異戊醇（25∶24∶1）混合液，上下顛倒混勻，13 000 r／min離心10 min，吸取上清液到新的EP管；

（5）加入0.5 ml氯仿，上下顛倒混勻，13 000 r／min離心10 min，吸取上清液到新的EP管，重復(fù)該步驟；

（6）在上清中加入1.0 ml提前－20℃預(yù)冷的無水乙醇，上下顛倒混勻可見絮狀物質(zhì)析出，4℃12 000 r／min離心20 min，小心棄去上清；

（7）用1 ml－20℃預(yù)冷的70%乙醇清洗沉淀兩次，每次13 000 rpm離心10 min，小心棄去上清；

（8）室溫干燥，加入70μl TE緩沖液，充分溶解后－20℃或－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 鹽析法［8］

（1）血凝塊的處理同酚／氯仿法步驟（1）－（3）；

（2）加1 ml SE緩沖液，用旋渦混勻器短暫混勻，放置于55℃水浴搖床10分鐘。

（3）加0.5 ml 5M氯化鈉溶液，充分混勻。室溫4 000 r／min離心15 min。

（4）加入純乙醇4 ml，蓋上靜置約30 min。上下緩慢顛倒數(shù)次，至DNA絮狀物析出。4000 r／min離心20 min，小心棄去上清，保留沉淀；

（5）用－20℃預(yù)冷的70%乙醇1 ml左右清洗，彈起沉淀，轉(zhuǎn)移至新的EP管中，13 000 rpm離心10 min。70%乙醇清洗可以視沉淀的顏色而增加次數(shù)。

（6）室溫干燥，加入70μl TE緩沖液，充分溶解后－20℃或－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA純度、濃度和完整性的檢測

使用DNA濃度測定儀對DNA的純度和濃度進行測量。兩組分別取50 ng DNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.2.3 PCR擴增

選擇基因片段（胰島素誘導(dǎo)基因2，INSIG2）進行擴增，上游引物：5’－TCCACGTCTTATTGACAGCAG－3’，下游引物：5’－GTAGTTCTTCTTCCCAA GGGC－3’，擴增片段長度為259 bp。PCR反應(yīng)體系為25μl，包含10×緩沖液2.5μl，MgCl2（20 m M）1.875μl，上下游引物（100μmol／L）各0.25μl，脫氧核苷三磷酸（10 m M）0.5μl；模板50 ng，TaqDNA聚合酶（2U／μl）0.5μl。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；35個循環(huán)（94℃變性30 s，58.5℃退火30 s，72℃延伸30 s），72℃10 min。

PCR擴增完成后，取5μl PCR產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.2.4 基質(zhì)支持的激光釋放／電離飛行時間質(zhì)譜分析（MALDI－TOF MS）

按照MALDI－TOF MS方法的標準流程對兩種不同方法提取的DNA樣本進行質(zhì)譜分析，對基因組DNA的32個單核苷酸多態(tài)性（SNP）同時進行分型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 DNA濃度和純度檢測結(jié)果

對兩種方法提取的基因組DNA的純度進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酚／氯仿法提取的基因組DNA純度高于鹽析法（P＜0.001），但兩組DNA純度平均值都高于1.80；比較兩組的濃度，沒有發(fā)現(xiàn)兩種方法提取的DNA濃度存在差異（P＝0.819）。采用1%瓊脂糖凝膠電泳，兩組DNA條帶均沒有出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象（圖1）。

表1 兩種方法提取的基因組DNA的純度和濃度比較（±s）酚／氯仿法（n＝40）鹽析法（n＝40） t值 P值純度（A260／280） 1.88±0.04 1.82±0.04 7.739 ＜0.001濃度（ng／μl）1204.05±404.95 1224.52±455.59 －0.229 0.819

2.2 PCR擴增結(jié)果比較

將兩種不同方法提取的DNA進行PCR擴增，其產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳效果如圖2。酚／氯仿和鹽析法提取的DNA均得到了有效擴增，且擴增效果無明顯差異。

圖1 兩種方法提取的基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 兩種方法提取DNA的PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 基質(zhì)支持的激光釋放／電離飛行時間質(zhì)譜分析（MALDI－TOF MS）結(jié)果

將兩種方法提取的DNA進行 MALDI－TOF MS檢測，如圖3所示，以rs2645424多態(tài)性的分型結(jié)果為例，兩組樣本在峰高度、峰形狀和基線水平等方面均沒有明顯差異。

圖3 不同方法提取DNA的MALDI－TOF MS檢測rs2645424多態(tài)性結(jié)果圖

3 討論

酚／氯仿法和鹽析法均是目前提取外周血基因組DNA的方法，本研究使用這兩種方法對外周血凝塊進行基因組DNA提取，并對提取效果進行了比較。

本研究所使用的酚／氯仿和鹽析法在處理血凝塊階段步驟一致，不同之處主要在純化和分離DNA方法不同。酚／氯仿法利用蛋白質(zhì)和DNA溶解于不用液相溶液而進行分離，可有效去除蛋白質(zhì)及色素等物質(zhì)，使DNA達到較高的純度；數(shù)次使用氯仿進行抽提，多次轉(zhuǎn)移DNA，操作步驟繁瑣復(fù)雜，處理多個樣本時間冗長；酚和氯仿均有揮發(fā)毒性，對環(huán)境造成諸多危害，長期使用嚴重危害實驗人員的健康。鹽析法利用DNA和蛋白質(zhì)等其它成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同以達到分離目的，與酚／氯仿法相比，鹽析法不需使用有毒的有機溶劑，只轉(zhuǎn)移DNA一次，操作簡便快捷，處理多個樣品的時間減少，工作效率提高。

在DNA產(chǎn)量方面，有文獻報道鹽析法獲取的DNA產(chǎn)量較高［9］，本實驗中鹽析法獲取的DNA產(chǎn)量稍高于酚／氯仿法，結(jié)果不具有統(tǒng)計學(xué)意義。酚／氯仿法中使用的市場上購買的飽和酚多不能達到PH 8.0，根據(jù)相似相溶原理，酸性酚會使DNA溶于其中，降低提取量［1］，而鹽析法不需要酚，不會面臨相同的問題；除此之外，鹽析法簡化了從消化液中提取DNA的步驟，減少了DNA轉(zhuǎn)移的次數(shù)，從而降低了DNA損失，因此DNA產(chǎn)量較高。但本實驗中沒有發(fā)現(xiàn)鹽析法獲取的DNA產(chǎn)量明顯高于酚／氯仿法，這可能是因為本實驗室使用酚／氯仿法提取DNA經(jīng)驗較多，DNA轉(zhuǎn)移中損耗較少。

在DNA純度方面，酚／氯仿法可有效去除蛋白質(zhì)及色素等物質(zhì)，使DNA達到較高的純度；而鹽析法利用高鹽濃度中DNA和其它物質(zhì)溶解度不同提取DNA，因存在鹽或其它物質(zhì)的殘留使DNA純度較低，有研究發(fā)現(xiàn)鹽析法提取的DNA純度低于酚／氯仿法［9］。本研究中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，但值得注意的是，鹽析法提取DNA純度也達到1.80的水平，在后續(xù)的PCR擴增實驗中，鹽析法提取的DNA得到了有效擴增，且擴增效果與酚／氯仿法無明顯差異。本研究還用兩種方法提取的DNA樣本進行MALDI－TOF MS檢測。MALDI－TOF MS檢測方法可對基因多態(tài)性進行高通量分型，極大的節(jié)省實驗時間，并且結(jié)果準確可靠，近年來在疾病遺傳病因領(lǐng)域廣泛應(yīng)用；但由于其昂貴的造價，保證DNA樣本的質(zhì)量顯得尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)鹽析法提取的DNA樣本完全可以滿足MALDI－TOF MS檢測的要求。

綜上所述，本實驗比較酚／氯仿法和鹽析法提取的外周血基因組DNA，發(fā)現(xiàn)鹽析法提取的DNA能滿足后續(xù)的PCR擴增和飛行質(zhì)譜實驗方法質(zhì)量要求；并且與酚氯仿相比，鹽析法操作方法簡單，耗時較短，還可避免使用對人體損傷較大的有機溶劑，是一種值得推廣的DNA提取方法。

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