多次小劑量STZ處理建立糖尿病大鼠模型及EGF與Gastrin聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胰島素分泌的影響

孟召祥，高 靜，張俊輝，劉靜秋，楊 麗，倪勁松＊

（1.吉林省人口生命科學(xué)技術(shù)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130041；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 病理科，吉林 長(zhǎng)春 130021；3.吉林大學(xué)人獸共患病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 人獸共患病研究所，長(zhǎng)春 130062；4.吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院）

2型糖尿病患者早期具有胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷的雙重因素，但不少患者在疾病晚期也出現(xiàn)胰島素分泌嚴(yán)重不足，需要外源性胰島素治療。糖尿病患者不但遭受胰島素注射所帶來的不便和痛苦，而且不能完全控制血糖穩(wěn)定并避免遠(yuǎn)期并發(fā)癥的發(fā)生。EGF與Gastrin聯(lián)合應(yīng)用可增加STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胰島中的β細(xì)胞數(shù)量，降低血糖［1］，并能使四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的血糖恢復(fù)正常［2］。Wilma L等發(fā)現(xiàn)EGF與Gastrin短期應(yīng)用即可使自發(fā)性糖尿病NOD鼠的胰島細(xì)胞群數(shù)量增多，并且逆轉(zhuǎn)NOD鼠的高血糖狀態(tài)［3］。本文采用小劑量STZ多次誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，通過免疫熒光和生化檢測(cè)技術(shù)，分析EGF與Gastrin聯(lián)合應(yīng)用對(duì)糖尿病大鼠模型胰腺功能的影響。

1 材料和方法

1.1 糖尿病模型動(dòng)物制備

清潔級(jí)健康 Wistar雄性大鼠48只，體重180 g－220 g，由本?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（中心許可證號(hào)：SCXK吉2003－001）。大鼠隨機(jī)分為兩組，其中實(shí)驗(yàn)組35只，對(duì)照組13只。實(shí)驗(yàn)組大鼠按照35 mg·Kg－1腹腔注射STZ－枸櫞酸鈉緩沖液，每周1次，連續(xù)4周。對(duì)照組大鼠給予p H4.0枸櫞酸鈉緩沖液腹腔注射，鼠尾采血測(cè)試血糖，以最后一次檢測(cè)血糖值≥11.1 mmol·L－1和尿糖≥ ＋＋＋為成模標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)算大鼠成模率及存活率，評(píng)估造模效果。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

將29只實(shí)驗(yàn)組成模大鼠隨機(jī)分為三組，即：Insulin治療組10只，EGF／Gastrin聯(lián)合治療組10只及DM對(duì)照組9只，另設(shè)正常對(duì)照組大鼠10只。EGF／Gastrin組給予 EGF（1μg·Kg－1）／Gastrin（3μg·Kg－1），每日1次皮下注射，連續(xù)14日；Insulin組給予長(zhǎng)效胰島素2 U／d，連續(xù)14日；DM對(duì)照組及正常對(duì)照組給予p H8.0 Tris－cl緩沖液。

1.3 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)

（1）大鼠一般情況：給藥期間觀察大鼠飲水量、尿量、體重變化及一般狀態(tài)。

（2）空腹血糖值：所有動(dòng)物處死前禁食不禁水8 h，鼠尾靜脈采血檢測(cè)空腹血糖值。

（3）血清胰島素及C肽含量：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后腹主靜脈取血，離心后分離上層血清，放射免疫法檢測(cè)大鼠血清胰島素及C肽含量，評(píng)估胰島功能。

（4）胰島中Insulin陽性表達(dá)細(xì)胞的變化

各組大鼠處死后，取胰腺于10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片。免疫熒光染色檢測(cè)Insulin表達(dá)情況。激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像，分析不同實(shí)驗(yàn)組大鼠胰腺Insulin陽性細(xì)胞數(shù)量及熒光強(qiáng)度的變化，評(píng)估胰島功能及損傷恢復(fù)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，各組間數(shù)據(jù)根據(jù)比較對(duì)象不同分別采用方差分析，q檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠糖尿病模型的建立

實(shí)驗(yàn)組大鼠注射STZ1周后，少數(shù)出現(xiàn)多尿現(xiàn)象，4周后表現(xiàn)尿量明顯增加，并出現(xiàn)多飲多食。實(shí)驗(yàn)組大鼠沒有出現(xiàn)死亡。每周體重檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠體重相對(duì)于正常對(duì)照組大鼠體重上升趨勢(shì)減緩。4次注射STZ后24 h，禁食8 h鼠尾采血法檢測(cè)大鼠空腹血糖值。35只實(shí)驗(yàn)組大鼠中有33只血糖值≥11.1 mmol·L－1，占總數(shù)的94%。33只達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)組大鼠的平均血糖值為15.6±3.01 mmol·L－1，較正常對(duì)照組顯著增高，見表1（P＜0.05）。腹腔注射STZ4周，每周檢測(cè)大鼠尿糖變化。第1、2、3、4周出現(xiàn)尿糖陽性3＋及以上的累計(jì)數(shù)量分別為6只，12只，20只，32只。分別占總數(shù)的17%、34%、57%、91%。根據(jù)成模標(biāo)準(zhǔn)，選取空腹血糖值≥11.1 mmol·L－1同時(shí)尿糖陽性3＋及以上的實(shí)驗(yàn)組大鼠為糖尿病模型大鼠，共32只，成模率為91%。

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠血糖值變化

組織學(xué)結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn)，正常大鼠胰島為橢圓形或圓形細(xì)胞團(tuán)，數(shù)量較多，均勻分布于胰腺腺泡之間。鏡下觀察胰島結(jié)構(gòu)清晰，無淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。而成模大鼠的胰島數(shù)量明顯減少，分布不均勻并出現(xiàn)不同程度的萎縮，胰島β細(xì)胞數(shù)量明顯減少并出現(xiàn)空泡變性，胰島空虛。胰島內(nèi)可見以淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1）。Insulin免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，成模大鼠胰島內(nèi)Insulin染色陽性的細(xì)胞明顯減少；且殘存胰島β細(xì)胞Insulin染色強(qiáng)度低于正常對(duì)照組（圖2），提示注射STZ后，胰島出現(xiàn)明顯的損傷，胰島β細(xì)胞被破壞、減少，殘存的β細(xì)胞Insulin合成功能下降。

圖1 HE染色檢測(cè)胰島破環(huán)情況

圖2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Insulin表達(dá)

2.2 EGF與Gastrin聯(lián)合應(yīng)用對(duì)糖尿病大鼠模型胰腺功能的影響

連續(xù)14天外源性胰島素治療后，間隔12小時(shí)鼠尾靜脈采血測(cè)量空腹血糖值。結(jié)果顯示10只Insulin組大鼠中有8只血糖值低于11.1 mmol·L－1，其中6只低于7.8 mmol·L－1，平均血糖值為8.0±4.38 mmol·L－1。EGF／Gastrin組大鼠中6只血糖值低于11.1 mmol·L－1，其中5只低于7.8 mmol·L－1，平均血糖值為11.2±6.43 mmol·L－1。DM組大鼠的血糖值隨著時(shí)間的推移變化較大。最高值為26.1 mmol·L－1，平均值為20.3±3.78 mmol·L－1。Insulin組大鼠血糖值同DM 組相比顯著降低（P＜0.05）。EGF／Gastrin組大鼠血糖值同DM組相比顯著降低（P＜0.05），但仍高于正常對(duì)照組與Insulin組（表2）。

表2 實(shí)驗(yàn)大鼠4次STZ注射前后空腹血糖值變化

2.3 血清胰島素含量及C肽含量變化

各組大鼠腹主靜脈取血，離心分離血清，放射免疫法檢測(cè)血清胰島素含量及C肽含量。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，DM組中血清胰島素及C肽含量顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.05），而Insulin組及EGF／Gastrin組均顯著高于DM組（P＜0.05）。說明Insulin及EGF／Gastrin聯(lián)合應(yīng)用均能促進(jìn)糖尿病大鼠胰島素的分泌（表3）。

表3 血清中胰島素及C肽含量

2.4 胰島β細(xì)胞Insulin表達(dá)變化

各組大鼠胰腺組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、切片后，采用免疫熒光染色法檢測(cè)Insulin表達(dá)情況。結(jié)果顯示在正常大鼠胰島中，Insulin陽性細(xì)胞分布均勻；DM組大鼠胰島中僅有少數(shù)幾個(gè)殘存的β細(xì)胞表達(dá)Insulin，且表達(dá)強(qiáng)度明顯低于正常對(duì)照組，與DM組比較，Insulin組及EGF／Gastrin組大鼠胰島中Insulin表達(dá)細(xì)胞明顯增多，有部分細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)（圖3）。

圖3 免疫熒光染色檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組中Insulin表達(dá)情況

3 討論

傳統(tǒng)的糖尿病模型復(fù)制方法，一般采用一次性大劑量注射STZ（＞60 mg／kg）誘導(dǎo)急性糖尿病的發(fā)生，注射72小時(shí)后血糖可穩(wěn)定升高，動(dòng)物出現(xiàn)三多一少的癥狀。但動(dòng)物死亡率高，且STZ集中大量破壞β細(xì)胞，使糖尿病很快發(fā)生，短期內(nèi)即達(dá)到糖尿病的臨床癥狀期，與發(fā)生在自身免疫性胰島炎基礎(chǔ)上的糖尿病在病程及發(fā)病機(jī)制方面存在較大差異，即免疫因素參與發(fā)病的特點(diǎn)不能被該模型所模擬。目前，較多學(xué)者開始致力于多次小劑量注射STZ誘導(dǎo)糖尿病模型的研究。一般認(rèn)為，小劑量STZ注射可破壞少量β細(xì)胞，死亡的β細(xì)胞作為抗原被巨噬細(xì)胞吞噬，產(chǎn)生TH1刺激因子（IL－12），使TH1細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)而產(chǎn)生IL－2及氧自由基NO、H2O2等，殺傷少量β細(xì)胞，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，死亡細(xì)胞再次以自身抗原釋放，并呈遞給APC細(xì)胞進(jìn)行處理，釋放細(xì)胞因子，放大細(xì)胞的損傷效應(yīng)，最終導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生［4，5］。

在本實(shí)驗(yàn)中，采用35 mg·Kg－1STZ腹腔注射，每周1次，連續(xù)4周，誘導(dǎo)雄性Wistar大鼠糖尿病模型，并對(duì)模型建立后大鼠的一般狀況、體重、血糖及尿糖等進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其死亡率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)進(jìn)而評(píng)價(jià)造模效果。結(jié)果顯示：首次注射STZ 1周后，少數(shù)大鼠出現(xiàn)多尿現(xiàn)象。4次注射后STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型鼠表現(xiàn)出明顯的糖尿病癥狀和病理改變。表現(xiàn)為飲水量、進(jìn)食量及尿量明顯增加，毛色失去光澤，鼠精神狀態(tài)差，血糖、尿糖水平明顯升高；病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)β細(xì)胞數(shù)量明顯減少，呈現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的胰島炎改變。4次STZ注射后實(shí)驗(yàn)組大鼠沒有出現(xiàn)死亡，每周體重檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠體重較對(duì)照組大鼠體重上升趨勢(shì)減緩。第4次注射STZ后24小時(shí)，鼠尾靜脈采血檢測(cè)大鼠血糖，94%的大鼠血糖值≥11.1 mmol·L－1。而且血糖持續(xù)在較高水平為出現(xiàn)波動(dòng)。每周檢測(cè)大鼠尿糖變化，發(fā)現(xiàn)尿糖＋＋＋以上的鼠隨注射STZ次數(shù)的增加而增多。這一現(xiàn)象說明單次給藥時(shí)較難出現(xiàn)糖尿病的臨床癥狀，可能因?yàn)榇藭r(shí)β細(xì)胞破壞較少未達(dá)到失代償水平，或者殘存β細(xì)胞發(fā)生代償而致糖尿病臨床癥狀不明顯。隨著STZ累積劑量的增加，β細(xì)胞被大量破壞并釋放自身抗原，不斷強(qiáng)化自身免疫反應(yīng)，破壞免疫抑制機(jī)制，最終導(dǎo)致穩(wěn)定持久的糖尿病的發(fā)生。且本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⑦^程中無大鼠死亡，說明多次小劑量STZ注射可明顯降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡率，在動(dòng)物模型存活方面占有明顯優(yōu)勢(shì)?？梢姡┝慷啻巫⑸銼TZ誘導(dǎo)的糖尿病模型可有效模擬人類糖尿病的發(fā)病機(jī)制及病程，并且動(dòng)物成模率高、死亡率低，模型穩(wěn)定。是糖尿病研究較理想的動(dòng)物模型。

胚胎時(shí)期胰島前體干細(xì)胞在多種生長(zhǎng)因子的刺激下最終發(fā)育為成熟的β細(xì)胞；成體的胰腺組織在發(fā)生胰腺炎或胰腺損傷后，胰腺修復(fù)再生過程中同樣出現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等生長(zhǎng)因子的表達(dá)增加。我們通過對(duì)血糖、血清胰島素及C肽的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，EGF／Gastrin治療組大鼠的血糖明顯低于糖尿病大鼠，但其仍然高于正常組大鼠。血清胰島素和C肽水平顯著高于糖尿病組大鼠。說明給予EGF／Gastrin聯(lián)合治療后大鼠的胰島功能有所恢復(fù)并開始合成內(nèi)源性胰島素。

EGF／Gastrin聯(lián)合治療糖尿病的作用機(jī)制尚不明確。有人認(rèn)為 給予EGF／Gastrin后可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞群增多，其分泌的胰島素足以維持血糖的正常水平［6］。也有資料表明，發(fā)生了糖尿病的NOD鼠給予EGF／Gastrin短期治療后即可導(dǎo)致β細(xì)胞數(shù)目的增多及胰島素含量的增加，并能降低胰島炎性反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)高血糖狀態(tài)，這些改變伴隨著免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的參與［7－9］。因此認(rèn)為，EGF／Gastrin聯(lián)合應(yīng)用在抑制自身免疫性β細(xì)胞破壞的同時(shí)可誘導(dǎo)β細(xì)胞再生。

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