雙靶向TRAIL過(guò)表達(dá)聯(lián)合輻射對(duì)乳腺癌MDA－MB－435細(xì)胞增殖和凋亡的影響

王 巍，陳文慶，王長(zhǎng)青，徐貴穎

（吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130012）

自1992年美國(guó)學(xué)者Weichaelbaum首次提出腫瘤基因－放射治療以來(lái)，經(jīng)過(guò)近二十年的不斷探索和發(fā)展，取得了非常的進(jìn)步。其基本理念是將腫瘤的基因治療引入到放射治療中，實(shí)現(xiàn)二種療法對(duì)腫瘤的雙重作用［1］。腫瘤基因－放射治療中如何選擇治療基因和提高基因的表達(dá)效率是非常關(guān)鍵的兩個(gè)問(wèn)題。本研究以腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TNF－related apoptosis inducing ligand，TRAIL）為治療基因，以其增加放療時(shí)射線誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡作用。另外，研究發(fā)現(xiàn)［2－4］條件復(fù)制型腺病毒作為載體時(shí)能夠特異性感染腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)此作用，顯著增加腫瘤細(xì)胞中目的基因的表達(dá)效率。而且，人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human relomerase reverse transcriptase，h TERT）基因啟動(dòng)子屬于腫瘤特異性啟動(dòng)子，將其置于腺病毒調(diào)控復(fù)制部分則能實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)高效復(fù)制［5］。因此，本研究利用h TERT和Egr－1啟動(dòng)子雙靶向介導(dǎo)TRAIL基因，進(jìn)而觀察對(duì)輻射誘導(dǎo)乳腺癌MDA－MB－435細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為乳腺癌的基因－放射治療提出新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

人乳腺癌MDA－MB－435細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞研究所；攜帶TRAIL的條件復(fù) 制 型 腺 病 毒 （載 體 為 pShuttle－Egr1－TRAIL－h(huán) TERT－E1A－E1Bp－E1B55K，命名為 CRAd.p Egr－1－TRAIL）由吉林大學(xué)衛(wèi)生部放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王志成博士惠贈(zèng)；高糖DMEM、胎牛血清、青霉素和鏈霉素（Gibco公司，美國(guó)）；CCK8試劑盒（DOjin DO公司，日本）；AnnexinⅤ－FITC試劑盒（南京凱基生物）；國(guó)產(chǎn) X 射線深部治療機(jī)（XSZ－220／20X型，丹東市康嘉儀器設(shè)備有限公司）；酶標(biāo)儀（Bio－Rad公司，美國(guó)）和流式細(xì)胞儀（BD公司，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組、病毒感染和照射

實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組（Control）、CRAd.p Egr－1－TRAIL 組、2.0 Gy 照 射 組 及 CRAd.p Egr－1－TRAIL＋2.0 Gy照射組。乳腺癌 MDA－MB－435細(xì)胞培養(yǎng)與含10%胎牛血清、100 U／ml青霉素和鏈霉素高糖DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2；待細(xì)胞80%－90%融合后將細(xì)胞用胰酶消化后接種于96孔（2×104個(gè)／孔）和6孔培養(yǎng)板中（1×106個(gè)／孔），24 h后按照預(yù)實(shí)驗(yàn)和參考文獻(xiàn)［6］。進(jìn)行病毒感染，感染滴度為5 MOI［Multiplicity of infection（virus／cell）］，24 h后進(jìn)行 X 射線照射。照射條件為200 k V電壓，10 m A電流，濾板為0.5 mm Cu和1.0 mm Al，靶皮距離為50 cm，劑量率為0.287 Gy／min。

1.3 CCK－8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖

采用CCK－8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖，按照實(shí)驗(yàn)分組 MDA－MB－435細(xì)胞進(jìn)行 CRAd.p Egr－1－TRAIL病毒感染和照射，照射后6、12、24和48 h按照說(shuō)明書加入10μl／孔CCK－8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，輕輕震蕩，酶標(biāo)儀于490 nm處檢測(cè)各孔吸光度A490值，以此表示細(xì)胞增殖能力［7］。

1.4 AnnexinⅤ／FITC試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡

采用AnnexinⅤ／FITC試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，按照實(shí)驗(yàn)分組 MDA－MB－435細(xì)胞進(jìn)行CRAd.p E－gr－1－TRAIL病毒感染和照射，照射后24 h收集細(xì)胞于玻璃離心管中，PBS洗2次后棄上清，每個(gè)離心管中加入500μl緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，加入5μl Annexin V－FITC和5μl PI，混勻，室溫避光反應(yīng)5－15 min，2 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)樣品收取1.0×104個(gè)細(xì)胞。CellQuest軟件收集并分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以細(xì)胞百分比表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件one－way ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05或P＜0.01表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 MDA－MB－435細(xì)胞增殖能力的變化

由表1可見(jiàn)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)各組MDA－MB－435細(xì)胞（CRAd.p Egr1－TRAIL＋2.0 Gy組48 h除外）均顯示增殖狀態(tài)，control和 CRAd.p Egr－1－TRAIL組基本一致；而2.0 Gy和CRAd.p Egr－1－TRAIL＋2.0 Gy組細(xì)胞增殖放緩，尤其是 CRAd.p Egr－1－TRAIL＋2.0 Gy組甚至在48 h時(shí)出現(xiàn)抑制。12 h時(shí)，CRAd.p Egr1－TRAIL ＋2.0 Gy組細(xì)胞增殖較control組顯著增加（P＜0.05），24和48 h時(shí)，2.0 Gy組和 CRAd.p Egr1－TRAIL ＋ 2.0 Gy組也較control組顯著增加 （P＜0.05，P＜0.01），且CRAd.p Egr1－TRAIL ＋2.0 Gy組較2.0 Gy組顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。

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2.2 MDA－MB－435細(xì)胞凋亡百分比的變化

圖1為各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析所得到直方圖，進(jìn)一步分析得到各組細(xì)胞凋亡百分比變化，分別為：control組 （3.31±0.58）、CRAd.p Egr1－TRAIL組（5.53±0.69）、2.0 Gy組（9.33±1.01）和 CRAd.p Egr1－TRAIL＋2.0 Gy 組 （14.23±1.34），其中2.0 Gy和 CRAd.pEgr1－TRAIL＋2.0 Gy組較control組增加顯著（P＜0.05，P＜0.01），CRAd.pEgr1－TRAIL＋2.0 Gy組較2.0 Gy組增加顯著（P＜0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明電離輻射能誘導(dǎo)MDA－MB－435細(xì)胞凋亡，且雙靶向TRAIL過(guò)表達(dá)能增加輻射誘導(dǎo)凋亡能力。

圖1 The apoptotic percentage changes of MDA－MB－435 cells in different groups after 2.0 Gy X－rays irradiation

3 討論

乳腺癌在女性惡性腫瘤中排名第1位，占女性新發(fā)惡性腫瘤的30%［8］。放射治療是乳腺癌臨床治療的重要手段之一，但是往往因?yàn)橹車＝M織的損傷和腫瘤自身輻射耐受影響放療療效，所以單獨(dú)的放射治療存在一定的限制［9］。腫瘤基因－放射治療是聯(lián)合基因治療和放射治療的一種新型腫瘤治療方法，目前已經(jīng)吸引了廣大科研工作者的興趣，具有廣闊的應(yīng)用前景［1］。但是目的基因的選擇和靶向性一直是非常關(guān)鍵，如果能夠有效的解決它們，則對(duì)這種療法的進(jìn)步具有重要意義。

腫瘤基因－放射治療的目的不僅包括抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)也要誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。凋亡是細(xì)胞死亡的方式之一，電離輻射可以直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并且誘導(dǎo)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的阻滯，這是臨床腫瘤放射治療的基礎(chǔ)。用一定的放射治療策略啟動(dòng)細(xì)胞凋亡能夠有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，這對(duì)腫瘤放療非常有意義［10］。TRAIL基因就是一個(gè)腫瘤細(xì)胞高效的誘導(dǎo)凋亡基因，而對(duì)正常細(xì)胞則無(wú)此作用，因此，本研究以其為靶基因，進(jìn)行乳腺癌基因放射治療的研究。另外，h TERT作為腫瘤特異性啟動(dòng)子可以用來(lái)作為條件復(fù)制型腺病毒腫瘤內(nèi)特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，而且還利用早期生長(zhǎng)因子（early growth response 1，Egr－1）啟動(dòng)子來(lái)介導(dǎo)TRAIL的輻射誘導(dǎo)表達(dá)，由此實(shí)現(xiàn)TRAIL的雙靶向性過(guò)表達(dá)，這一思路已有文獻(xiàn)表明，且效果較好［6］。本實(shí)驗(yàn)采用人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞 MDA－MB－435作為研究對(duì)象，探討雙靶向TRAIL過(guò)表達(dá)對(duì)輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為乳腺癌的放射治療提供必要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，感染CRAd.p Egr1－TRAIL病毒對(duì) MDA－MB－435細(xì)胞的增殖能力無(wú)明顯影響，而對(duì)凋亡則能夠誘導(dǎo)增加的趨勢(shì)，可能和病毒感染只有24 h，病毒復(fù)制的量不夠有關(guān)；2.0 Gy照射后細(xì)胞增殖受到抑制，且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的顯著增加（P＜0.05），并且感染該病毒后再給予2.0 Gy的照射，細(xì)胞增殖抑制的更明顯，且細(xì)胞凋亡增加的更顯著（P＜0.01），這說(shuō)明二者對(duì)抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡起到了協(xié)同的作用。上述結(jié)果對(duì)乳腺癌的基因－放射治療起到重要的啟示，選擇高效的治療基因和提高腫瘤的靶向性，能夠顯著增加治療效果。

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