超氧化物歧化酶及其應(yīng)用的研究進(jìn)展

徐靖

（西安外事學(xué)院醫(yī)學(xué)院，陜西西安710077）

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase；SOD）是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過(guò)氧化氫，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用，與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展密不可分[1-2]。其分布較廣，于微生物及動(dòng)植物中的均有發(fā)現(xiàn)，按所含金屬離子主要分為三類(lèi)：鐵超氧化物歧化酶（Fe-SOD）、錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）[3-4]，已有研究表明，在生物體內(nèi)存在還存在一種細(xì)胞外銅鋅超氧化物歧化酶（EC-SOD）[5]。在鏈霉菌屬中還存在一種鎳超氧化物歧化酶Ni-SOD[6]，此外在S coelicotor中曾報(bào)道存在性質(zhì)類(lèi)似于Fe-SOD的Fe/Zn-SOD[7]。超氧化物歧化酶能夠修復(fù)受損細(xì)胞，復(fù)原自由基對(duì)人及動(dòng)植物機(jī)體造成的損傷。超氧化物歧化酶具有許多獨(dú)特的生物及生理學(xué)特性，可以治療多種疾病，并且在防輻射、抗腫瘤，植物抗逆性等方面也有積極的作用。本文從超氧化物歧化酶的定義及分類(lèi)、結(jié)構(gòu)、分布、測(cè)定方法以及其自身特性的應(yīng)用方面進(jìn)行綜述，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)其潛在應(yīng)用價(jià)值提供理論參考。

1 SOD的基本概念

1.1 超氧化物歧化酶的結(jié)構(gòu)及特性

Fe-SOD由3個(gè)His、1個(gè)Asp和1個(gè)H2O形成扭曲的配位四面體[8]。Mn-SOD則是氨基酸殘基構(gòu)成的四面體。Cu/Zn-SOD分子是由非共價(jià)鍵疏水相互作用連接的兩個(gè)相同的亞基通過(guò)締合形成四方錐結(jié)構(gòu)[9-13]。三種SOD的主要理化特性詳見(jiàn)表1。

1.2 超氧化物歧化酶的分布

真菌里一般含Mn-SOD和Cu/Zn-SOD。大多數(shù)真核藻類(lèi)在其葉綠體基質(zhì)中存在Fe-SOD，類(lèi)囊體膜上結(jié)合著Mn-SOD，而多數(shù)藻類(lèi)中不含Cu/Zn-SOD。植物細(xì)胞中的Fe-SOD主要存在于葉綠體中[16]。大多數(shù)原始的無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞中都存在Cu/Zn-SOD，脊椎動(dòng)物則一般含有Cu/Zn-SOD和Mn-SOD。人、鼠、豬、牛等紅細(xì)胞和肝細(xì)胞中含Cu/Zn-SOD，且其主要存在于細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)也存在于線(xiàn)粒體內(nèi)外膜之間。而從人和動(dòng)物肝細(xì)胞中也純化了Mn-SOD，其一般存在于線(xiàn)粒體基質(zhì)中[17]。

2 超氧化物歧化酶的測(cè)定

超氧化物歧化酶活性的主要測(cè)定方法有鄰苯三酚自氧化法、黃嘌呤氧化酶-細(xì)胞色素C還原法[18]、化學(xué)發(fā)光法及熒光動(dòng)力學(xué)法等。近年來(lái)又建立了多種新方法，如簡(jiǎn)易凝膠過(guò)濾擴(kuò)散法、放射免疫法、極譜氧電極法、微量測(cè)活方法等[19-22]。嚴(yán)萬(wàn)里等[23]鑒定了SOD活性測(cè)定中的影響因素，為研究SOD活性的測(cè)定提供理論參考。

3 超氧化物歧化酶特性的應(yīng)用及修飾

3.1 超氧化物歧化酶基因多態(tài)性在病理學(xué)方面的應(yīng)用

哺乳動(dòng)物組織存在的Cu/Zn-SOD（SOD1）、Mn-SOD（SOD2）和EC-SOD（SOD3）分別在機(jī)體中發(fā)揮著獨(dú)立的作用[24-26]，它們的表達(dá)因在不同組織和疾病狀態(tài)下而不同。a.Cu/Zn-SOD的活性的增加會(huì)減輕氧化物增多而造成的肝損傷[17]。VALENTINE JS等[27]研究顯示，家族性側(cè)索硬化癥與Cu/Zn-SOD的基因突變存在相關(guān)性。b.Mn-SOD則可以清除由呼吸鏈反應(yīng)中所產(chǎn)生的自由基，減輕機(jī)體所受到的過(guò)氧化導(dǎo)致的損傷[28-29]。Kazuhiko等[30]的研究表明MnSOD基因多態(tài)性與冠心病、血漿總超氧化物歧化酶（T-SOD）和Mn-SOD活性的有關(guān)系。楊茂平等[31]采用比色法測(cè)定血漿T-SOD和Mn-SOD活性，檢測(cè)了冠心病患者和對(duì)照者的Mn-SOD基因多態(tài)性，結(jié)果顯示，MnSOD的基因多態(tài)性通過(guò)影響血漿Mn-SOD活性成為導(dǎo)致冠心病加劇的危險(xiǎn)因素。c.EC-SOD是一種分泌性糖蛋白，其可以清除體內(nèi)多余的O·，保護(hù)一氧化氮的活性，在人體血管中NO可以調(diào)節(jié)血壓、抑制血小板和黏附、聚集舒張動(dòng)脈、改變血管的基礎(chǔ)張力從而保持血管血流暢通[32]。EC-SOD的過(guò)表達(dá)可以有效減少肺損傷中嗜中性粒細(xì)胞的堆積，從而減輕肺部急性炎癥[33-34]。EC-SOD的多態(tài)性除了與抗氧化作用有關(guān)外，還發(fā)現(xiàn)與血壓升高和腦梗死的范圍增加有關(guān)[35-36]。人體關(guān)節(jié)中含有大量的EC-SOD，它們結(jié)合在關(guān)節(jié)軟骨的匯總的I型膠原蛋白上，可以有效地清除氧自由基，保護(hù)膠原蛋白，可以期待在將來(lái)可以將EC-SOD可能會(huì)成為預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的有效藥物[37]。

表1 三種過(guò)氧化物歧化酶的理化性質(zhì)[14-15]Table1 Physiochemical characteristics of three SODs

還有學(xué)者認(rèn)為慢性酒精中毒就是因?yàn)轶w內(nèi)的超氧化物歧化酶由于酒精的過(guò)量攝入而減少，從而導(dǎo)致過(guò)多的O·留在機(jī)體中，攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，形成多種脂質(zhì)過(guò)氧化物，使細(xì)胞流動(dòng)性下降，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙。因此提高體內(nèi)SOD水平，有利于慢性酒精中毒者的治療[38]。

3.2 超氧化物歧化酶在抗腫瘤方面的應(yīng)用

高濃度活性氧會(huì)損傷細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、DNA和蛋白質(zhì)，使健康的正常細(xì)胞受到刺激轉(zhuǎn)化為腫瘤[39]。而Mn-SOD活性對(duì)細(xì)胞的這種靜止和擴(kuò)增的轉(zhuǎn)換可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧的水平來(lái)控制[40]。大量研究證實(shí)Mn-SOD與癌癥的易感性和治療效果有關(guān)系。MnSOD表達(dá)缺失或表達(dá)水平的下降，可誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡。鼻咽癌中MnSOD的表達(dá)比正常組織中的含量明顯升高[41]，而王明臣等[42]發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中MnSOD的轉(zhuǎn)錄水平明顯低于正常組織。張默涵等[43]的研究表明：乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中Mn-SOD mRNA和蛋白表達(dá)明顯下降，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)檢測(cè)MnSOD的表達(dá)可作為臨床診治及判定乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌愈后的指標(biāo)。薛玉仙等[44]進(jìn)行的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Mn-SOD可以明顯誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡；而轉(zhuǎn)染MnSOD cDNA的骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯的抑制。

3.3 超氧化物歧化酶對(duì)輻射的防護(hù)作用

癌癥患者在接受放射治療時(shí)，會(huì)引發(fā)電離輻射損傷[45]。放射產(chǎn)生的氧自由基（ROS）的連鎖反應(yīng)會(huì)造成細(xì)胞生物膜損傷，導(dǎo)致生物分子的氧化損傷，酶活性降低或者消失，引發(fā)放射后效應(yīng)，因此，阻斷ROS的產(chǎn)生或清除已產(chǎn)生的ROS是防治放射損傷的有效策略[46]。以O(shè)·為特異性識(shí)別底物的SOD是生物體防御氧化損傷的一種重要的酶，是放射損傷較理想的防護(hù)劑[47]。有報(bào)道表明重組人源性Mn-SOD（rhMn-SOD）對(duì)小鼠紫外線(xiàn)輻射所致的外周器官氧化損傷有一定的保護(hù)作用[48]，而小鼠腹腔注射CuZn-SOD能減輕急性輻射造成的皮膚損傷[49]。Lefaix等[50]研究表明肌注Cu/Zn-SOD能使輻射引起的皮膚纖維化衰退。Jin等[51]將野生型和缺少胞質(zhì)C，Zn-SOD、線(xiàn)粒體Mn-SOD或者二者均缺的突變型酵母菌株暴露于離子輻射中，結(jié)果表明，突變型的菌株對(duì)輻射更敏感，而野生型菌株有更高的抗氧化酶活性。說(shuō)明超氧化物歧化酶可以保持抗氧化酶的活性，并且使機(jī)體免受離子輻射危害。

3.4 超氧化物歧化酶在植物抗逆性方面的應(yīng)用

大多數(shù)植物由于其在生長(zhǎng)過(guò)程中在自然界中易受到強(qiáng)光、干旱、溫度和輻射等外界因子的脅迫，而這些逆境條件都會(huì)引起自身ROS含量的升高而給植物細(xì)胞帶來(lái)細(xì)胞損傷，因此植物抗逆性是實(shí)際生產(chǎn)中備受關(guān)注的一個(gè)問(wèn)題。姜巖巖等[52]研究得出低溫敏感性番茄通過(guò)提高SOD的活性來(lái)適應(yīng)低溫；耐低溫的番茄受傷害程度較低。姚冉等[53]從一株地?zé)嵫挎邨U菌（Geobacillus）中克隆得到Cu/Zn-SOD基因，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pZP211-Cu/ZnSOD，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)對(duì)煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行耐鹽性檢測(cè)，證明Cu/Zn-SOD基因確實(shí)能夠提高煙草對(duì)鹽脅迫的耐受。

近年來(lái)也有采用體外組織或是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)SOD誘導(dǎo)進(jìn)行研究，結(jié)果表明：在實(shí)驗(yàn)材料一致，SOD對(duì)外界條件的可控制性和靈敏性方面存在優(yōu)勢(shì)，同時(shí)還能夠消除器官分化帶來(lái)的影響[54]。

不同的SOD基因在轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)主要有兩種：一種是過(guò)量表達(dá)SOD的轉(zhuǎn)基因植株未提高脅迫耐性，另一種是SOD過(guò)量表達(dá)賦予轉(zhuǎn)基因植株較好的活性氧脅迫耐性。通過(guò)轉(zhuǎn)SOD基因技術(shù)來(lái)培育高抗逆農(nóng)作物新品種和基因克隆與表達(dá)技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)SOD的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，已成為國(guó)內(nèi)外SOD研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[55]。這其中既包括了來(lái)自細(xì)菌如大腸桿菌的Fe-SOD基因，也有來(lái)自動(dòng)植物細(xì)胞如人的Cu/Zn-SOD基因[56]。Mn-SOD在煙草和玉米葉綠體中的過(guò)量表達(dá)能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草和玉米對(duì)質(zhì)膜的保護(hù)作用和對(duì)除草劑引起的氧脅迫的耐受性[57，59]。研究者將煙草的Mn-SOD cDNA轉(zhuǎn)入苜蓿使其在轉(zhuǎn)基因植株線(xiàn)粒體中過(guò)量表達(dá)，從而提高了冷害的耐受性和下一年的產(chǎn)量；還有報(bào)道稱(chēng)Mn-SOD融合基因轉(zhuǎn)移到煙草的葉綠體中之后，可以抵抗除草劑引起的氧脅迫[57-58]。

雖然SOD基因的過(guò)量表達(dá)在一定程度上提高了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)氧脅迫的耐受性，但是仍需要SOD與其他的抗氧化酶共同作用才能使超氧物陰離子自由基被有效清除[60]。

3.5 超氧化物歧化酶的修飾

雖然超氧化物歧化酶有許多的生理及生物學(xué)特性可以為人類(lèi)加以利用，但是在相關(guān)領(lǐng)域?qū)嶋H應(yīng)用時(shí)，由于其有許多缺陷限制了其應(yīng)用。為了克服這些缺點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者嘗試各種方式對(duì)SOD分析進(jìn)行改造。

3.5.1 聚乙二醇（PEG）修飾超氧化物歧化酶 將利用三聚氯氰活化法、氰脲酰氯法等活化后的PEG與SOD縮合，修飾SOD。尹亮等發(fā)現(xiàn)修飾效果最好的是分子量6000的PEG，有較強(qiáng)的酸、堿和酶抗性，并且活性殘余率較高，修飾后的SOD各方面的耐受性顯著提高[61-62]，其溫度穩(wěn)定性與天然蛋白相比也有明顯的提高。

3.5.2 脂肪酸類(lèi)修飾超氧化物歧化酶 研究表明，月桂酸修飾后的得到的SOD，與天然SOD相比，溫度、pH、人胃液中的穩(wěn)定性大大提高，回收率提高到90%以上，酶活提高了一倍[63-64]。

3.5.3 糖類(lèi)修飾超氧化物歧化酶 殼聚糖是聚陽(yáng)離子黏多糖，活性基團(tuán)羥基、氨基等可以被活化劑活化。Liu等用研究結(jié)果表明，兩種糖化SOD都能夠顯著升高細(xì)胞內(nèi)SOD酶活以及增強(qiáng)對(duì)小鼠腹腔誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的親和力，從而更好的被巨噬細(xì)胞攝?。贿M(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，兩種多糖修飾物均能夠有效降低由60Coγ射線(xiàn)輻射誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子TGF-β及IL-1β的表達(dá)[65-66]。

3.5.4 β-環(huán)狀糊精修飾超氧化物歧化酶 用β-環(huán)狀糊精修飾的SOD，78℃作用40m in后，活力保留率比未修飾的酶提高21.3%，pH 4和pH10的酸堿環(huán)境中分別作用40m in后，活力保留率比未修飾的酶分別提高10.2%和29.5%[67]。

3.5.5 固化酶技術(shù)修飾超氧化物歧化酶 交聯(lián)劑固定化酶通常情況下，殼聚糖作為載體，利用交聯(lián)劑將本身的活性基團(tuán)結(jié)合于戊二醛等分子上，再與SOD結(jié)合。采用殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑的固定方法進(jìn)行了SOD的制備，制備好的固定化SOD在許多方面明顯優(yōu)于天然SOD，強(qiáng)堿和強(qiáng)酸條件下，保持著高活性。這種包埋固定技術(shù)得到了具有穩(wěn)定保存，抗酸抗堿等諸多優(yōu)點(diǎn)的SOD[68-69]。

3.5.6 脂質(zhì)體包裹修飾超氧化物歧化酶 利用冷凍干燥法，薄膜分散法，超聲波分散法等將SOD包封于類(lèi)脂質(zhì)雙分子層中，形成微型泡囊體，制備脂質(zhì)體SOD。將未修飾的SOD和用脂質(zhì)體包裹的SOD分別作用于肝癌細(xì)胞，后者在作用2h后，肝癌細(xì)胞中伴隨著GSH顯著提高，活性氧水平明顯降低，說(shuō)明修飾的SOD有效地降低了細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，有明顯的抗氧化效果，說(shuō)明脂質(zhì)體SOD有穩(wěn)定性、靶向性、定向性等特點(diǎn)[70]。

修飾后的SOD不僅能夠保留天然酶的活性，還具有了更加較之天然SOD顯著的諸多優(yōu)勢(shì)如：a.半衰期的延長(zhǎng)，b.免疫原性的降低，c.膜通透能力的增加，d.理化性質(zhì)的優(yōu)化。這些特點(diǎn)將使其的應(yīng)用領(lǐng)域進(jìn)一步拓展。

4 展望

人類(lèi)的衰老與人體內(nèi)的ROS的生成密切相關(guān)，且已有研究表明，超氧化物歧化酶與人的大腦記憶、表達(dá)和調(diào)控能力有關(guān)。進(jìn)一步研究控制SOD表達(dá)量在癌癥中發(fā)揮的作用，可以作為一種臨床診斷的指標(biāo)，成為判定及治療腫瘤中的藥物靶點(diǎn)[71]。在存在適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑及基質(zhì)的條件下，補(bǔ)充外源的超氧化物歧化酶可以調(diào)節(jié)人體代謝、提高免疫力，對(duì)防止某些疾病、抗輻射治療對(duì)機(jī)體的損傷、延緩人體衰老有一定的作用，可以考慮將其作為食品中的保鮮劑、抗氧化劑以及營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，有著很大的開(kāi)發(fā)潛力。

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