曾廣翔,陸惠邦,孫勝玲,寧正祥,蘇 蘭,韋慶益,*
(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州510641;2.中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所,同位素地球化學(xué)國家重點實驗室,廣東廣州510640)
食品是人類賴以生存的基本物質(zhì),它提供給人類生活所需要的各種營養(yǎng)素和能量。通過消耗食品中的營養(yǎng)物質(zhì),細菌、酵母和真菌等可以迅速繁殖,從而導(dǎo)致食品發(fā)生微生物感染[1]。隨著生活水平的提高,人們越來越注重食品的質(zhì)量問題。因此,增強食品的安全性是十分有必要的。利用合成的化學(xué)食品防腐劑來控制微生物的生長以及防止食品腐敗,是最常用的方法之一[2]。目前,國內(nèi)常用的食品防腐劑按成分和來源不同,主要分為酯型防腐劑、酸性防腐劑、生物防腐劑和無機防腐劑四類[3-4]。食品防腐劑的構(gòu)效研究表明:α、β-不飽和羰基結(jié)構(gòu)是食品防腐劑具有抗菌活性的有效功能性結(jié)構(gòu)之一[5]。本文以山梨酸、苯丙氨酸和丙醇為原料,通過酰氯的方法對山梨酸進行改性,合成具有廣譜抑菌作用的化合物山梨酸苯丙氨酸丙酯。此藥物有望作為新型的食品防腐劑,也有望應(yīng)用于化妝品、皮具、木材等領(lǐng)域的防霉抗菌,具有廣泛的應(yīng)用前景。
1.1 材料及儀器
山梨酸 化學(xué)純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;L-苯丙氨酸 含量≥98.0%,上海伯奧生物科技有限公司;乙醇 分析純,上海市凌峰化學(xué)試劑有限公司;氯化亞砜 分析純,天津市光復(fù)精細化工研究所;氫氧化鈉、石油醚(Ⅰ)、氯化鈉、蔗糖、無水葡萄糖 分析純,廣州化學(xué)試劑廠;乙酸乙酯 分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;硅膠粉 100~200目,上海誼恒工貿(mào)有限公司;牛肉膏、瓊脂粉 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;馬鈴薯 市售;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 用于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、牛奶酸敗混合菌的培養(yǎng);馬鈴薯培養(yǎng)基 用于釀酒酵母和黑曲霉的培養(yǎng)[6];枯草芽孢桿菌(Bacillus subtili)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、牛奶酸敗混合菌、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、黑曲霉(Aspergillus niger) 由華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院提供。
AvanceIII 400核磁共振儀 瑞士布魯克公司;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市英浴高科儀器廠;RE-S2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;S20型實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;YX-18LD型手提式壓力蒸汽滅菌鍋 江門濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;THZ-82A型水浴恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司;721G型可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;SPX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司設(shè)備廠。
1.2 實驗方法
1.2.1 山梨酸苯丙氨酸乙酯的合成 苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽的合成:向裝有低溫溫度計的100m L三口燒瓶中加入無水乙醇30m L。向其中加入一定比例的苯丙氨酸和氯化亞砜,冰鹽浴中反應(yīng)1h,再加熱回流,直至固體完全消失。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去剩余的乙醇及SOCl2,得到中間體苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽[7-9]。
山梨酸的酰氯化反應(yīng):向100m L圓底燒瓶中加入摩爾比為1∶3的山梨酸和氯化亞砜,在常溫下攪拌反應(yīng)1h。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去剩余的SOCl2,得到酰氯化后的山梨酸。
山梨酸苯丙氨酸乙酯的合成:向100m L圓底燒瓶中加入摩爾比為1∶1的苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽和酰氯化后的山梨酸,冰鹽浴反應(yīng)3h,室溫反應(yīng)4h。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去低沸點物質(zhì),得到山梨酸苯丙氨酸乙酯粗品(圖1)。合成山梨酸苯丙氨酸乙酯反應(yīng)式如下:
圖1 山梨酸苯丙氨酸乙酯反應(yīng)式Fig.1 Synthesis of ethyl N-[1-oxo-2,4-hexadien-1-yl]-L-phenylalaninate
1.2.2 苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽工藝參數(shù)優(yōu)化實驗
1.2.2.1 單因素實驗 固定苯丙氨酸與氯化亞砜摩爾比1∶3,反應(yīng)溫度60℃,考察反應(yīng)時間分別為2、3、4、5、6h時對苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的影響。固定苯丙氨酸與氯化亞砜摩爾比1∶3,反應(yīng)時間4h,考察反應(yīng)溫度分別為50、60、70、80、90℃時對苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的影響。固定反應(yīng)時間4h,反應(yīng)溫度60℃,考察苯丙氨酸與氯化亞砜摩爾比分別為1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5和1∶4.0時對苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的影響。
1.2.2.2 正交實驗 為了優(yōu)化反應(yīng)條件和提高反應(yīng)收率,在單因素條件實驗的基礎(chǔ)上,以苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽的收率為考察指標(biāo),選擇反應(yīng)時間(A)、反應(yīng)溫度(B)和物料配比(C)為考察因素,以收率為考察指標(biāo),進行正交實驗,其正交實驗因素與水平見表1。
表1 正交實驗因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal test
1.2.3 苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的計算 公式如下:
1.2.4 產(chǎn)物的分離純化 用乙酸乙酯對合成產(chǎn)物進行萃取,再用濃度為20g/L的NaOH溶液進行洗滌初步純化,最后經(jīng)層析柱(固定相為硅膠粉,流動相為石油醚∶乙酸乙酯=2∶1)進一步純化后,得到純品山梨酸苯丙氨酸乙酯。
1.2.5 最低抑菌濃度(M IC)測定 最低抑菌濃度的測定采用平板涂布法:將不同濃度的防腐劑溶液加入到已經(jīng)滅菌的培養(yǎng)皿中,然后加入一定體積的培養(yǎng)基,充分混合以達到所需要的濃度。待培養(yǎng)基冷卻后,加入等量的菌懸液0.1m L,用涂布器涂布均勻,置于37℃(細菌)培養(yǎng)24h;28℃(酵母)培養(yǎng)48h;28℃培養(yǎng)72h(霉菌)。觀察菌體的生長情況,從無菌生長的培養(yǎng)皿中找出最低藥物濃度的培養(yǎng)皿,此皿的藥物濃度即為該藥物的最低抑菌濃度[10-11]。
1.2.6 微生物生長曲線測定 采用比濁法,100m L無菌營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中,接入0.5m L牛奶酸敗混合菌菌液,37℃恒溫培養(yǎng),測定不同培養(yǎng)時間樣品在560nm波長下的吸光值A(chǔ)560。以時間為橫坐標(biāo),吸光值A(chǔ)560為縱坐標(biāo),繪制微生物生長曲線[12-13]。抑菌率按下式計算:
式中:△t,k和△t,i分別為空白與樣品在t時刻A560與接種時(t=0)A560相比的增量[14]。
1.2.7 核磁共振 以四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)物,其化學(xué)位移值為0,以氘代氯仿為溶劑,測定樣品的1H核磁共振譜。
2.1 單因素實驗
2.1.1 反應(yīng)時間對苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的影響
由圖2可知,當(dāng)反應(yīng)時間為2h時,苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽的收率只有40.7%。隨著反應(yīng)時間的增加,苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽的收率也相應(yīng)增大。當(dāng)反應(yīng)時間為4h時,苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽的收率達到最高,為89.4%。而繼續(xù)增加反應(yīng)時間,苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽的收率略有下降,可能是由于時間過長導(dǎo)致副產(chǎn)物增多緣故。
圖2 反應(yīng)時間對苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的影響Fig.2 The effect of reaction time on the yeild of L-Phenylalanine ethyl ester hydrochloride
2.1.2 反應(yīng)溫度對苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的影響
由圖3可知,當(dāng)反應(yīng)溫度低于60℃時,苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率隨著反應(yīng)溫度的增加而增加;當(dāng)反應(yīng)溫度大于60℃時,苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率隨著反應(yīng)溫度的增加而略有降低,可能是由于溫度過高導(dǎo)致氯化亞砜不斷揮發(fā),從而降低了氯化亞砜和乙醇分子碰撞的機會,進一步影響最終產(chǎn)率。
圖3 反應(yīng)溫度對苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的影響Fig.3 The effectof reaction temperature on the yield of L-Phenylalanine ethyl ester hydrochloride
圖4 物料配比對苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的影響Fig.4 The effectofmaterial ratio on the yield of L-Phenylalanine ethyl ester hydrochloride
2.1.3 苯丙氨酸與氯化亞砜的摩爾比對苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的影響 由圖4可知,當(dāng)苯丙氨酸與氯化亞砜的摩爾比為1∶3時,苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率較高。繼續(xù)增加氯化亞砜用量,苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率反而下降。這是因為氯化亞砜極易揮發(fā),部分過量有利于反應(yīng)進行,但當(dāng)氯化亞砜的量增加到一定程度時,便加大了氯化亞砜雙鍵聚合的可能性,導(dǎo)致收率下降。
2.2 苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽正交實驗
苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽正交實驗結(jié)果如表2所示。從表2極差R的大小可以看出,影響苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的因素大小依次為:B>C>A,即主次順序依次為:反應(yīng)溫度、物料配比、反應(yīng)時間。由k值可得合成苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽的工藝條件為A1B2C3,即反應(yīng)時間3.5h、反應(yīng)溫度60℃、苯丙氨酸與氯化亞砜的摩爾比1∶3.2。驗證實驗表明,此條件下苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽的收率為93.8%。
表2 正交實驗設(shè)計與結(jié)果Table2 Design and results of orthogonal test
2.3 產(chǎn)物表征
表3 山梨酸苯丙氨酸乙酯的1H NMR譜數(shù)據(jù)Table3 1H NMR data of ethyl N-[1-oxo-2,4-hexadien-1-yl]-L-phenylalaninate
產(chǎn)品為淺黃色固體,熔點69.8~72.2℃。其1H NMR譜數(shù)據(jù)如表3所示,1H NMR可提供化學(xué)位移、峰面積積分值、自旋分裂數(shù)和耦合常數(shù)幾方面的數(shù)據(jù),根據(jù)這些數(shù)據(jù)可對產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進行鑒定。從表3可以看出,氫原子總數(shù)為21個,與山梨酸苯丙氨酸乙酯分子式的氫原子數(shù)一致。另外,H的化學(xué)位移值與氫原子所在官能團的位置呈一一對應(yīng)關(guān)系,其與山梨酸苯丙氨酸乙酯結(jié)構(gòu)式的氫原子位置一致。因此,可確定產(chǎn)物為山梨酸苯丙氨酸乙酯。
2.4 最低抑菌濃度測定
由表4可知,山梨酸苯丙氨酸乙酯對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和牛奶酸敗混合菌的最低抑菌濃度分別為2.50、0.75、2.00、2.50mmol/L,與山梨酸抑菌效果相當(dāng),其中對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌效果優(yōu)于山梨酸。表明山梨酸苯丙氨酸乙酯對食品常見污染菌具有較強的抑菌活性。而山梨酸對釀酒酵母和黑曲霉的最低抑菌濃度分別為4.50mmol/L和4.00mmol/L,比山梨酸苯丙氨酸乙酯的抑菌效果要好。
表4 山梨酸苯丙氨酸乙酯對供試菌的最低抑菌濃度(mmol/L)Table4 Antimicrobial activity of ethyl N-[1-oxo-2,4-hexadien-1-yl]-L-phenylalaninate against the selected microorganisms determined as theminimal inhibitory concentration(MIC,inmmol/L)
2.5 山梨酸苯丙氨酸乙酯對牛奶酸敗混合菌的生長抑制作用
實驗中,山梨酸苯丙氨酸乙酯和山梨酸的添加量都為2.5mmol/L。由圖5可以看出,在pH等于7的中性條件下,空白對照組中牛奶酸敗混合菌快速生長繁殖,當(dāng)時間為12h時,菌液的OD560nm值便達到了0.984。而山梨酸和山梨酸苯丙氨酸乙酯的細菌生長適應(yīng)期均延長至了24h,抑菌率達到90%以上,表明山梨酸和山梨酸苯丙氨酸乙酯具有明顯的抑菌作用。在pH等于5的酸性條件下,山梨酸表現(xiàn)出較好的抑菌效果,其48h內(nèi)菌液的OD560nm值在0.1以下。山梨酸苯丙氨酸乙酯的抑菌效果則與在中性條件下的抑菌效果相當(dāng),24h內(nèi)可顯著抑制細菌的生長。在pH等于9的堿性條件下,山梨酸苯丙氨酸乙酯依然具有較好的抑菌活性,使得牛奶酸敗混合菌的適應(yīng)期延長至36h。但山梨酸在pH等于9的堿性條件下,當(dāng)時間為18h,抑菌率在10%以下,表明其幾乎完全失去了抑菌活性。
綜上所述,山梨酸雖然具有較強的抑菌效果,但僅在酸性條件下得以發(fā)揮其作用。在中性條件下,山梨酸的抑菌效果則大大降低。而在堿性條件下,山梨酸幾乎沒有任何抑菌活性,可能是由于反應(yīng)生成鹽后改變了其性質(zhì)的緣故。山梨酸苯丙氨酸乙酯的抑菌效果受體系pH影響較小,在不同的pH條件下依然可以保持較強的抑菌活性。
3.1 以山梨酸、苯丙氨酸和乙醇為原料,通過酰氯反應(yīng),可以較高效率地合成山梨酸苯丙氨酸乙酯。合成苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽最佳工藝條件為:反應(yīng)時間3.5h,反應(yīng)溫度60℃,苯丙氨酸和氯化亞砜的摩爾比1∶3.2,此時收率可達93.8%。
圖5 山梨酸苯丙氨酸乙酯對牛奶酸敗混合菌的生長抑制作用Fig.5 The growth inhibition effect on themixed bacteria from ranciditymilk of ethyl N-[1-oxo-2,4-hexadien-1-yl]-L-phenylalaninate
3.2 山梨酸苯丙氨酸乙酯對腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和牛奶酸敗混合菌的最低抑菌濃度分別為2.50、0.75、2.00、2.50mmol/L,其抑菌效果要優(yōu)于防腐劑山梨酸。
3.3 山梨酸苯丙氨酸乙酯在不同的pH體系均具有較強的抑菌活性,有望作為新型防腐劑應(yīng)用于食品、化妝品領(lǐng)域。
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