高產(chǎn)M onacolin K紅曲霉菌種的誘變選育及液態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化

胡文效，魏彥鋒，蔣錫龍，史紅梅，李彥奎，劉一凡

（山東省葡萄研究院，山東濟(jì)南250100）

我國(guó)利用紅曲霉的歷史悠久，主要是在釀酒中的應(yīng)用以及利用其紅色素對(duì)食品著色[1]。1979年日本學(xué)者Endo A等[2]發(fā)現(xiàn)紅曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物Monacolin K及其類似物具有羥甲基戊二醛輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑的作用。目前Monacolin K已成為各國(guó)公認(rèn)的最佳血脂調(diào)節(jié)物[3-4]，對(duì)產(chǎn)Monacolin K紅曲霉菌株的選育成為熱點(diǎn)，唐偉等[5]對(duì)產(chǎn)Monacolin K紅曲霉菌株進(jìn)行了亞硝酸和UV復(fù)合誘變，選育出產(chǎn)Monacolin K含量達(dá)到18.7mg/L的紅曲霉菌株，吳學(xué)倩等[6]通過(guò)紅曲霉原生質(zhì)體誘變和融合，選育出一株高產(chǎn)Monacolin K菌株，其固體發(fā)酵含量可達(dá)3328.6μg/g。

桔霉素是一種真菌毒素，1995年法國(guó)學(xué)者Blanc在紅曲霉的發(fā)酵物中檢測(cè)出桔霉素[7]，其具有腎毒性、致癌性、致突變等作用[8]。桔霉素副作用的存在嚴(yán)重制約了紅曲酶的應(yīng)用[9]，之前的研究只注重Monacolin K的含量，對(duì)桔霉素的關(guān)注不多。優(yōu)良菌株是生產(chǎn)高品質(zhì)、高產(chǎn)量Monacolin K的基礎(chǔ)和關(guān)鍵[5]，誘變篩選是獲得優(yōu)良紅曲霉菌株的有效途徑。目前我國(guó)紅曲霉液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K的報(bào)道和研究不是很多，原因在于液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量低。但液態(tài)發(fā)酵也具有自身優(yōu)點(diǎn)，其規(guī)模大且生產(chǎn)過(guò)程便于自動(dòng)化控制，勢(shì)必將節(jié)省生產(chǎn)成本。本研究通過(guò)三次誘變，以期篩選出高產(chǎn)Monacolin K且低桔霉素的菌株，并對(duì)其液態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行研究和探討。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米 市售；出發(fā)菌株 實(shí)驗(yàn)室分離及購(gòu)買(mǎi)的紅曲霉菌株29株，編號(hào)M 1～M 29，紅曲霉培養(yǎng)后測(cè)定Monacolin K的含量及桔霉素含量，確定以M 2為誘變出發(fā)菌株；Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品、桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司；瓊脂、葡萄糖、酵母膏、硫酸銨、磷酸二氫鉀 國(guó)藥集團(tuán)，分析純；酵母膏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 酵母膏8g，葡萄糖100g，瓊脂15g，蒸餾水1000m L，pH自然，121℃滅菌30m in，用于菌種活化；大米培養(yǎng)基 將大米于30℃水中浸泡2h，瀝干，分裝于500m L三角瓶（100g/瓶）瓶）中，121℃滅菌20m in，趁熱打散，冷卻備用；限量培養(yǎng)基 葡萄糖1.0g，硫酸銨0.5g，蒸餾水1000m L，pH自然，121℃滅菌30m in，用于紅曲霉孢子萌動(dòng)；液體培養(yǎng)基 葡萄糖60g，蛋白胨25g，酵母膏5g，硫酸銨5g，磷酸二氫鉀0.25g，蒸餾水補(bǔ)足1000m L，pH 6.0，121℃滅菌30m in，用于紅曲霉產(chǎn)Monacolin K的液態(tài)培養(yǎng)。

YXQG02型手提式電熱壓力蒸汽消毒器 山東新華安得醫(yī)療用品有限公司；SW-CJ-ZD型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；GSP-9160MBE型隔水式恒溫靜置培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HZQQ型全溫振蕩器 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；Sigma 3-30K型實(shí)驗(yàn)室高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；Infinity 1260型HPLC儀 安捷倫科技有限公司；BILONG2-IIDL型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 上海比朗儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Monacolin K的HPLC檢測(cè)條件 Monacolin K檢測(cè)的色譜條件參考文獻(xiàn)[9]。

檢測(cè)波長(zhǎng)：紫外吸收光譜掃描結(jié)果顯示Monacolin K在231、238、246nm處有三個(gè)特征吸收峰，238nm處吸收值最大，231nm次之。因此HPLC檢測(cè)時(shí)，選238、231nm為吸收峰，其中定性測(cè)定時(shí)參考238、231nm的圖譜，定量測(cè)定參考238nm條件下的圖譜。

色譜條件：色譜柱C18（5μm，150mm×4.6mm），流動(dòng)相乙腈：0.1%磷酸（V/V）65∶35，柱溫25℃，流速1m L/m in。在以上條件下Monacolin K達(dá)到基線分離。稱取Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品21.5mg，用無(wú)水乙醇溶液溶解定容至100m L容量瓶。精確稱取8、6、2、0.5m L、0.2m L定容至10m L，混合均勻。10μL進(jìn)樣測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 桔霉素的檢測(cè)條件 桔霉素檢測(cè)色譜條件參考文獻(xiàn)[10]。色譜柱：C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-磷酸水溶液（5.0m L/L）=72-28；流速：1.0m L/m in；熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)：331nm；發(fā)射波長(zhǎng)：500nm。將桔霉素標(biāo)樣質(zhì)量濃度分別稀釋為0.25、0.5、1.0、2.0、5.0μg/m L。以峰面積為縱坐標(biāo)，桔霉素濃度為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 Monacolin K提取方法 發(fā)酵產(chǎn)物的處理：固體紅曲米研磨至20目，液態(tài)產(chǎn)物離心棄上清，沉淀物50～60℃烘干，研磨至20目。

提取方法：70%乙醇為提取溶劑，500W超聲波細(xì)胞破碎15m in，料液比為1∶6。

1.2.4 誘變處理

1.2.4.1 出發(fā)菌株孢子懸浮液制備 斜面種子用含0.9%NaCl無(wú)菌水洗滌紅曲孢子，制備孢子懸浮液[11-12]，通過(guò)鏡檢將孢子懸浮液稀釋至104～105之間。

1.2.4.2 UV誘變 取0.1m L孢子懸液，涂布于PDA平板，UV 0.3m處照射，設(shè)置對(duì)照和時(shí)間梯度。照射后30℃暗培養(yǎng)7～8d，計(jì)算致死率，選擇合適處理時(shí)間進(jìn)行誘變選育。

1.2.4.3 LiCl誘變 配制0.2‰～1.6‰LiCl溶液，吸取0.2m L，涂布平板，完全吸收后，取孢子懸液0.1m L涂布，30℃培養(yǎng)7d，計(jì)算致死率，選擇合適的處理劑量進(jìn)行誘變選育。

1.2.4.4 硫酸二乙酯+氯化鋰復(fù)合誘變 將孢子懸液用硫酸二乙酯（1%）處理30～70m in，28℃，置于搖床，150r/min，每10min取樣，測(cè)得硫酸二乙酯（1%）的致死率，選擇合適的處理時(shí)間與氯化鋰進(jìn)行復(fù)合誘變選育。

1.2.5 發(fā)酵條件的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 碳源與氮源的選擇 以液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，測(cè)定碳源（含量7%）（甘油、葡萄糖、乳糖、大米粉、玉米粉、大米粉水解液、玉米粉水解液），氮源（含量0.5%）（酵母膏、牛肉膏、硝酸鈉、蛋白胨、硫酸銨）對(duì)Monacolin K含量的影響。5%接種量，30℃，150r/m in培養(yǎng)12d，測(cè)定Monacolin K含量。

1.2.5.2 土豆汁或豆芽汁對(duì)Monacolin K含量的影響

培養(yǎng)基：甘油7%，大米粉水解液2%，蛋白胨0.5%，土豆汁或豆芽汁補(bǔ)足1000m L，pH 6.0。5%接種量，30℃，150r/m in培養(yǎng)12d，測(cè)定Monacolin K含量。

1.2.5.3 鎂離子、鋅離子對(duì)Monacolin K含量的影響培養(yǎng)基：甘油7%，大米粉水解液2%，蛋白胨0.5%，豆芽汁補(bǔ)足1000m L，pH6.0，MgSO（40.1%、0.5%）和ZnSO4（0.2%、0.3%）分別加入。5%接種量，30℃，150r/m in培養(yǎng)12d，測(cè)定Monacolin K含量。

1.2.5.4 接種量對(duì)Monacolin K含量的影響 培養(yǎng)基：甘油7%，大米粉水解液2%，蛋白胨0.5%，豆芽汁補(bǔ)足1000m L，pH 6.0。不同接種量（3%、4%、5%、6%、7%、8%）接入種子液，培養(yǎng)條件：30℃，150r/m in培養(yǎng)12d，測(cè)定Monacolin K含量。

1.2.5.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)Monacolin K含量的影響 培養(yǎng)基：甘油7%，大米粉水解液2%，蛋白胨0.5%，豆芽汁補(bǔ)足1000m L，pH 6.0。接種量5%，30℃，搖床轉(zhuǎn)速（r/m in）分別為100、120、140、160、180、200，培養(yǎng)12d，測(cè)定Monacolin K含量。

1.2.5.6 發(fā)酵液中甘油含量對(duì)Monacolin K含量的影響 培養(yǎng)基：碳源甘油含量分別為6%、7%、8%、9%、10%，大米粉水解液2%，蛋白胨0.5%，MgSO40.1%，ZnSO40.2%，5%接種量，豆芽汁補(bǔ)足1000m L，pH6.0。30℃，150r/m in培養(yǎng)12d，測(cè)定Monacolin K含量。1.2.5.7 發(fā)酵液中蛋白胨含量對(duì)Monacolin K含量的影響 培養(yǎng)基：甘油7%，大米粉水解液2%，MgSO40.1%，ZnSO40.2%，蛋白胨含量梯度分，別為0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.5%，豆芽汁補(bǔ)足1000m L，pH6.0。5%接種量，30℃，150r/m in培養(yǎng)12d，測(cè)定Monacolin K含量。

1.2.5.8 發(fā)酵溫度對(duì)Monacolin K含量的影響 培養(yǎng)基：甘油7%，大米粉水解液2%，蛋白胨0.5%，MgSO40.1%，ZnSO40.2%，豆芽汁補(bǔ)足1000m L，pH 6.0。接種5%，發(fā)酵溫度分別為26、28、30、32℃，150r/m in培養(yǎng)12d，測(cè)定Monacolin K含量。

1.2.5.9 起始pH對(duì)Monacolin K含量的影響 培養(yǎng)基：甘油7%，大米粉水解液2%，蛋白胨0.5%，MgSO40.1%，ZnSO40.2%，豆芽汁補(bǔ)足1000m L，用6%HCl和2.0mol/L的NaOH調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基的pH分別為4.5、5.0、5.5、6.0。5%接種量，30℃，150r/m in培養(yǎng)12d，測(cè)定Monacolin K含量。

1.2.6 發(fā)酵條件的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化 選取甘油含量、蛋白胨含量、發(fā)酵溫度及液體培養(yǎng)基起始pH四個(gè)因素進(jìn)行4水平的正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 紅曲霉培養(yǎng)條件正交因素與水平表Table1 Experimentassignmentof the level and factor of Monascus culture conditions

1.2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及最佳發(fā)酵時(shí)間的確定 根據(jù)單因素及正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在最優(yōu)培養(yǎng)基和最優(yōu)發(fā)酵條件下對(duì)篩選菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵14d，每天測(cè)定Monacolin K含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC法測(cè)定Monacolin K和桔霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見(jiàn)圖1，其回歸方程為y= 403.63x+5.4176，R2=0.9998，相關(guān)性良好，線性范圍為：0.0043～0.172mg/m L。

圖1 HPLC法測(cè)定Monacolin K含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Monacolin K contentmeasured by HPLC

桔霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見(jiàn)圖2，其回歸方程為y= 1463438x+69412，R2=0.9998，相關(guān)性良好，線性范圍為：0.25～5μg/m L。

圖2 HPLC測(cè)定桔霉素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curve of citrinin contentmeasured by HPLC

2.2 菌種的誘變

2.2.1 誘變劑的確定 由表2可知，UV處理5m in、 1.2‰氯化鋰誘變以及1%硫酸二乙酯處理60m in時(shí)的致死率分別為97.1%、98.7%和98.1%。

表2 誘變劑的確定Table2 The determination ofmutagen

2.2.2 UV誘變菌株的篩選 UV誘變處理后，獲得48株變異菌株，編號(hào)：Mu-1～Mu-48。5株菌株Monacolin K產(chǎn)率提高且桔霉素含量較低（見(jiàn)表3），其中Mu-29菌株Monacolin K產(chǎn)量最高且桔霉素的量最低，故選擇其為氯化鋰誘變的出發(fā)菌株。

表3 UV處理突變株的Monacolin K和桔霉素含量Table3 Contents of Monacolin K and citrinin in mutant strainsmutagenized by UV

2.2.3 氯化鋰誘變菌株的篩選 氯化鋰誘變后，獲得變異菌株35株，編號(hào)：ML-1～ML-35，其中5株Monacolin K產(chǎn)率提高明顯，且桔霉素含量較低（見(jiàn)表4），菌株ML-21的Monacolin K產(chǎn)量最高，達(dá)0.957mg/g，故以ML-21為出發(fā)菌株進(jìn)行硫酸二乙酯誘變。

表4 氯化鋰突變株的Monacolin K和桔霉素含量Table4 Contents ofMonacolin K and citrinin in mutant strainsmutagenized by LiCl

表5 復(fù)合誘變菌株的Monaco1in K和桔霉素含量Table5 Contents ofMonacolin K and citrinin in mutant strainsmutagenized by LiCl and diethyl sulfate

2.2.4 硫酸二乙酯+氯化鋰復(fù)合誘變菌株的篩選 獲得3株突變株，其Monacolin K的含量提高明顯且桔霉素含量較低，其中MS-12產(chǎn)率提高最大（見(jiàn)表5），故選擇其為選育的目的菌株。

表6 碳源對(duì)紅曲霉產(chǎn)Monacolin K的影響Table6 Effectof carbon sources on Monacolin K contentof Monascus

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 液態(tài)發(fā)酵最佳碳源的確定 碳源是微生物生長(zhǎng)代謝最重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，它是構(gòu)成菌體和代謝物、為菌體生命活動(dòng)提供能量的最重要的物質(zhì)。7種單一碳源實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表6，甘油是最有利于提高M(jìn)onacolin K產(chǎn)量的單一碳源，產(chǎn)量為86.1μg/m L，大米水解液次之為56.2μg/m L。根據(jù)單一碳源的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇3種復(fù)合碳源，其他條件不變進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，其中甘油7%+大米粉水解液2%作為復(fù)合碳源，Monacolin K的產(chǎn)量達(dá)到124.2μg/m L（見(jiàn)表6）?？赡苁歉视?大米粉水解液更有利于紅曲霉MS-12菌株的生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的生成，故選擇其為紅曲霉發(fā)酵的碳源。

2.3.2 液態(tài)發(fā)酵最佳氮源的確定 氮源是構(gòu)成菌體細(xì)胞中核酸、蛋白質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)的主要成分，也是合成各種含氮代謝產(chǎn)物的重要原料。由表7可知，蛋白胨為氮源時(shí)的產(chǎn)量最高為123.4μg/m L，其次是酵母膏和牛肉膏。無(wú)機(jī)氮源硝酸鈉和硫酸銨目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量都比較低，可能是有機(jī)氮為遲效氮源，這種利用方式不易產(chǎn)生某些代謝產(chǎn)物的過(guò)分積累而阻礙目的物質(zhì)的產(chǎn)生，即代謝產(chǎn)物的阻遏作用。因此確定蛋白胨為最佳的氮源。

表7 氮源對(duì)紅曲霉產(chǎn)Monacolin K的影響Table7 Effects of nitrogen sources on Monacolin K contentof Monascus

表8 添加土豆汁或豆芽汁對(duì)紅曲霉產(chǎn)Monacolin K的影響Table8 Effectofmurphy juice and bean sprouts juice on Monacolin K contentof Monascus

2.3.3 土豆汁或豆芽汁對(duì)紅曲霉菌株MS-12產(chǎn)Monacolin K的影響 分別以蒸餾水、土豆汁和豆芽汁配制的液體培養(yǎng)基發(fā)酵MS-12其Monacolin K產(chǎn)量見(jiàn)表8，土豆汁和豆芽汁都可不同程度地提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，特別是豆芽汁中含有的豐富的氨基酸和維生素等物質(zhì)，能夠更好地促進(jìn)Monacolin K的產(chǎn)生。其中采用豆芽汁目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量提高較大，產(chǎn)量達(dá)到142.1μg/m L，故選擇豆芽汁配制紅曲霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.3.4 MgSO4和ZnSO4對(duì)紅曲霉M 2菌株產(chǎn)Monacolin K的影響 鎂離子是許多酶的激活劑，鋅是乙醇脫氫酶和乳酸脫氫酶的輔基。它們的存在可能會(huì)在微生物的代謝過(guò)程中起著特殊的作用，對(duì)菌體的生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生有一定的作用。由表9可以看出，添加MgSO4和ZnSO4對(duì)Monacolin K的產(chǎn)量都有提高，其中0.1%MgSO4和0.2%ZnSO4對(duì)Monacolin K的產(chǎn)量提高較大，確定該濃度為兩種硫酸鹽的添加濃度。

2.3.5 不同接種量對(duì)Monacolin K產(chǎn)量的影響 由圖3可知，接種量為6%時(shí)目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量最高為137.9μg/m L。接種量低時(shí)，Monacolin K積累較少，可能由于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)豐富，有利于菌體的生長(zhǎng)而不利于Monacolin K的積累。較大的接種量可縮短生長(zhǎng)達(dá)到高峰的時(shí)間，使產(chǎn)物的合成提前，且種子液多時(shí)其胞外水解酶類含量也多，利于基質(zhì)的利用及Monacolin K的產(chǎn)生和積累。而接種量過(guò)大，菌種生長(zhǎng)過(guò)快，對(duì)發(fā)酵后期次級(jí)代謝產(chǎn)物Monacolin K積累有一定的阻遏作用，其Monacolin K的生成量也相對(duì)較低。故最佳接種量為6%。

圖3 接種量對(duì)紅曲霉產(chǎn)Monacolin K的影響Fig.3 Effectof inoculum size on Monacolin K content of Monascus

表9 MgS04和ZnSO4對(duì)紅曲霉產(chǎn)Monacolin K的影響Table9 EffectofMgSO4 and ZnSO4 on Monacolin K contentof Monascus

2.3.6 發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)Monacolin K產(chǎn)量的影響 紅曲霉是一種好氣性微生物，發(fā)酵過(guò)程中需向發(fā)酵培養(yǎng)基中不斷通入凈化過(guò)濾后的空氣，保證發(fā)酵液中溶氧的含量，并使溶解氧分布均勻是菌體生長(zhǎng)繁殖的重要條件。從圖4可知，并非轉(zhuǎn)速越大，Monacolin K的產(chǎn)量越高，轉(zhuǎn)速為140～160r/m in時(shí)，Monaco1in K的產(chǎn)量較大。轉(zhuǎn)速過(guò)大，雖能增加溶解氧含量，提供紅曲霉足夠的營(yíng)養(yǎng)成分。但因機(jī)械損傷加大或菌體呈現(xiàn)團(tuán)塊狀生長(zhǎng)而影響其菌體的自由蔓延，從而導(dǎo)致生長(zhǎng)的生物量降低。故最佳轉(zhuǎn)速為150r/min。

圖4 轉(zhuǎn)速對(duì)紅曲霉產(chǎn)Monacolin K的影響Fig.4 Effectof the rotate speed on Monacolin K content of Monascus

2.4 紅曲霉液態(tài)發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 發(fā)酵液中甘油含量對(duì)Monacolin K含量的影響

液體發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油含量對(duì)Monacolin K含量的影響見(jiàn)圖5，蛋白胨含量增加，產(chǎn)物的含量隨之增加，但當(dāng)甘油含量10%時(shí)，產(chǎn)物含量降低，可能因?yàn)樘嫉冗^(guò)高，菌體代謝不平衡，造成產(chǎn)物積累下降。

圖5 甘油含量對(duì)紅曲霉產(chǎn)Monacolin K的影響Fig.5 Effectof glycerol contenton Monacolin K content of Monascus

2.4.2 發(fā)酵液中蛋白胨含量對(duì)Monacolin K含量的影響 液體發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白胨含量對(duì)Monacolin K含量的影響見(jiàn)圖6，隨著蛋白胨含量的增加，Monacolin K產(chǎn)量增加，但蛋白胨含量大于1%時(shí)，蛋白胨含量增加，產(chǎn)物的含量在減少。這是因?yàn)閷?duì)微生物培養(yǎng)時(shí)，碳氮比過(guò)高過(guò)低都不利于微生物的生長(zhǎng)，碳氮過(guò)低菌體提前自溶，碳氮比過(guò)高菌體代謝不平衡，不利于代謝產(chǎn)物的積累。故蛋白胨含量1%為適合濃度。

2.4.3 發(fā)酵溫度對(duì)Monacolin K含量的影響 不同發(fā)酵溫度下液態(tài)發(fā)酵物中Monacolin K的含量見(jiàn)圖7，隨著溫度的升高，Monacolin K含量增高，在30℃時(shí)達(dá)到最高值，32℃產(chǎn)物的含量下降。這是因?yàn)闇囟鹊蜁r(shí)紅曲霉的生長(zhǎng)和代謝都慢，產(chǎn)物積累少；而溫度過(guò)高時(shí)，紅曲霉生長(zhǎng)快，達(dá)到對(duì)數(shù)期早，菌體自溶也早，不利于產(chǎn)物積累。

圖7 發(fā)酵溫度對(duì)紅曲霉產(chǎn)Monacolin K的影響Fig.7 Effectof fermentation temperature on Monacolin K contentof Monascus

2.4.4 起始pH對(duì)Monacolin K含量的影響 不同起始pH條件下Monacolin K含量見(jiàn)圖8，產(chǎn)物含量在pH 5.0時(shí)最高，pH升高或降低，產(chǎn)物的含量都呈降低趨勢(shì)，說(shuō)明pH 5.0時(shí)紅曲霉的生長(zhǎng)代謝適合產(chǎn)物Monacolin K的積累，是最適起始pH。

圖8 起始pH對(duì)紅曲霉產(chǎn)Monacolin K的影響Fig.8 The effectof pH on Monacolin K contentof Monascus

2.5 正交實(shí)驗(yàn)

選取甘油含量、蛋白胨含量、發(fā)酵溫度及液體培養(yǎng)基起始pH四個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表10。

由表10可知，各因素中發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中Monacolin K的含量影響最大，發(fā)酵液中甘油的含量次之，再次是發(fā)酵液中蛋白胨的含量，發(fā)酵液起始pH影響最小，即C＞A＞B＞D。最優(yōu)發(fā)酵條件組合為A4B3C2D3，即甘油含量9%，蛋白胨含量1.0%，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵液起始pH 5.0。

表10 紅曲霉發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table1 0 Results of orthogonal testof Monascus fermentation

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及液態(tài)發(fā)酵時(shí)間的確定

圖9 不同發(fā)酵時(shí)間Monacolin K含量Fig.9 Monacolin K contents at different fermentation time

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油含量9%，大米水解液2%，蛋白胨含量1.0%，硫酸鎂0.1%，硫酸鋅0.2%，磷酸二氫鉀0.25%，豆芽汁補(bǔ)至1000m L，pH 5.0，加入0.1mol/L的EDTA 40μL[13]。接種量6%，發(fā)酵溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/m in。發(fā)酵14d，每天測(cè)定Monacolin K含量。結(jié)果見(jiàn)圖9，Monacolin K含量在12d時(shí)達(dá)到最高為264.7μg/m L，12d后Monacolin K含量逐漸降低，由此可知，紅曲霉的最佳發(fā)酵時(shí)間為12d，Monacolin K最高產(chǎn)量為264.7μg/m L，此時(shí)桔霉素含量?jī)H為0.026ng/m L。

3 結(jié)論

通過(guò)UV誘變、氯化鋰誘變以及硫酸二乙酯與氯化鋰復(fù)合誘變?nèi)握T變選育，篩選出紅曲霉突變菌株MS-12，其固態(tài)發(fā)酵Monacolin K產(chǎn)量為1.346mg/g，提高顯著，且MS-12菌株與出發(fā)菌株相比桔霉素含量變化不大。經(jīng)過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化，MS-12在液態(tài)發(fā)酵條件下Monacolin K的含量達(dá)到264.7μg/m L，而桔霉素的含量?jī)H為0.026ng/m L。

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