紅菜苔廢棄物中多酚的超聲波水提工藝優(yōu)化

代立婷，李 婭，何玲玲，唐文娟，劉超立，李建華

（特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北工程學(xué)院，湖北孝感432000）

紅菜苔（Brassica campestris L.var.purpurea Baileysh）又名洪山菜苔，俗稱油菜苔。是十字花科蕓苔屬蕓苔種白菜亞種的變種，也是原產(chǎn)中國的特產(chǎn)蔬菜，武漢、長沙、成都是其三個原產(chǎn)中心[1]，紅菜苔以花苔供食，營養(yǎng)價值較高，含有鈣、磷、鐵、胡蘿卜、素核黃素、尼克酸、抗壞血酸等成分，為蔬菜中的佳品，但其莖皮含纖維素較多，可食性差，在食用前通常被人們剝下丟棄。植物多酚（p lant polyphenol）是自然界中分布廣泛的植物次生代謝產(chǎn)物[2]，是一類分子結(jié)構(gòu)中有若干個酚性羥基的物質(zhì)的總稱，包括茶多酚、黃酮類、原花青素等。多酚類化合物具有抗氧化[3]、抗紫外輻射[4]、改善微循環(huán)[5]等功能，在醫(yī)藥、食品和飼料等領(lǐng)域均有一定的應(yīng)用前景，提取植物多酚是當(dāng)前的一個熱點(diǎn)。常用的多酚提取方法多以有機(jī)溶劑作為提取劑，輔以加熱回流、超聲、微波等。由于作為提取劑的乙醇、甲醇和丙酮等有一定毒性且在后續(xù)工序中很難完全去掉，同時也增加了生產(chǎn)成本，因此不適宜食品及醫(yī)藥工業(yè)用多酚的生產(chǎn)[6]。使用水作為溶劑提取植物多酚等活性物質(zhì)，可避免有機(jī)物在產(chǎn)品中的殘留及對環(huán)境的污染[7]；超聲波產(chǎn)生的空化、振動、粉碎、攪拌等綜合效應(yīng)可破壞細(xì)胞壁，增加溶劑穿透力，提高植物多酚等活性物質(zhì)的提取率和縮短提取時間[8]，而且應(yīng)用超聲波提取細(xì)胞內(nèi)容物，不會對提取物的結(jié)構(gòu)、活性產(chǎn)生影響[9]。本研究以水為溶劑，結(jié)合超聲波這一輔助手段，探討超聲波功率、液料比和提取時間對紅菜苔廢棄物多酚提取的影響，對充分利用農(nóng)業(yè)廢棄物資源，高效無污染地提取紅菜苔廢棄物多酚具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅菜苔 產(chǎn)自湖北省孝感市，采摘新鮮紅菜苔，將剝?nèi)〉那o皮在40℃烘箱中干燥至手捏即碎后粉碎過60目篩備用；沒食子酸 天津市紅巖化學(xué)試劑廠；Folin-Ciocalteau試劑 自制，磷鉬鎢酸-碳酸鈉顯色體系；蒸餾水、碳酸鈉 上海聯(lián)試化工試劑有限公司。

Cary 60型紫外可見分光光度計(jì) 安捷倫科技（中國）有限公司；202-2型干燥箱 上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠；PL203型電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；H-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；康佳BCD-138UTS型冰箱 安徽康佳電器有限公司；DL-480D型智能超聲波清洗器 上海之信儀器有限公司；100～1000μL微量移液器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Folin-Ciocalteau法的比色條件優(yōu)化 以沒食子酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品，確定用Folin-Ciocalteau法[10]在本實(shí)驗(yàn)室條件下檢測紅菜苔多酚含量的最優(yōu)條件：取50μg/m L的沒食子酸溶液，在500～900nm的波長下進(jìn)行波譜掃描，確定檢測波長；各取1m L 50μg/m L沒食子酸溶液置于10支試管中，分別加入1m L濃度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的Folin-Ciocalteau試劑，再各加入3.0m L 7.5% Na2CO3，蒸餾水定容至10m L，20℃避光靜置1h，在前述確定的波長下測定吸光度值，確定Folin-Ciocalteau試劑濃度；在前述優(yōu)化條件下，在濃度在5%～15%之間均勻設(shè)置5個Na2CO3試劑濃度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定最佳Na2CO3濃度；在前面已確定的條件下，分別在避光和不避光的條件下進(jìn)行靜置顯色反應(yīng)1h，確定靜置時是否需要避光；在前述優(yōu)化條件下，反應(yīng)溫度在15～45℃均勻設(shè)置4個梯度、顯色時間從10～90m in均勻設(shè)置5個梯度，全組合設(shè)計(jì)，確定最佳顯色時間和最佳反應(yīng)溫度。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程 以沒食子酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品，配制濃度分別為0、10、20、30、40、50、60、80、100μg/m L沒食子酸溶液，分別取0.5m L標(biāo)準(zhǔn)液于20m L刻度試管中，采用上述已優(yōu)化的Folin-Ciocalteau法比色條件，測定吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.2.3 超聲波水提法提取多酚的單因素實(shí)驗(yàn) 先后在液料比為40∶1、提取時間為15m in的條件下，將超聲波功率設(shè)置為0、96、192、288、384、480W 6個梯度；在超聲波功率為192W、提取時間為15m in的條件下，將液料比均勻設(shè)置為30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（m L/g）共5個梯度；在超聲波功率為192W、液料比為40∶1的條件下，將提取時間設(shè)置為5、10、15、20、25min 5個梯度，來分別確定進(jìn)行響應(yīng)曲面分析時超聲波功率、料液比和提取時間的取值范圍。

1.2.4 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為研究超聲波功率、料液比以及提取時間對多酚提取的互作效應(yīng)，用Design-Expert軟件中的中心復(fù)合設(shè)計(jì)（Central composite design，CCD）模塊中的旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)了一組3因素5水平的共計(jì)20次的實(shí)驗(yàn)（full CCD設(shè)計(jì)）以進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平編碼見表1。

表1 中心組合設(shè)計(jì)因素水平表Table1 Central composite design factors levels table

1.2.5 紅菜苔廢棄物多酚的提取與檢測 采摘新鮮紅菜，將剝?nèi)〉那o皮在40℃烘箱中干燥至手捏即碎后粉碎過60目篩，準(zhǔn)確稱取0.5g于燒杯中，按照中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的不同提取條件分別進(jìn)行浸提，抽濾后收集各個提取條件下得到的提取液，用優(yōu)化了的檢測條件進(jìn)行檢測并換算成每克干燥紅菜苔莖皮中多酚的含量（mg/g，以沒食子酸的重量計(jì)）。

2 結(jié)果與討論

2.1 Folin-Ciocalteau法比色條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

經(jīng)優(yōu)化，確定Folin-Ciocalteau法檢測多酚的波長為768nm；Folin-Ciocalteau試劑濃度為50%，確定Na2CO3最佳濃度為7.5%，可不避光靜置，最佳顯色時間為30min，最佳反應(yīng)溫度為45℃。

以沒食子酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品，在上述優(yōu)化條件下得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.0155x+0.0611，其中y為吸光值，x為沒食子酸溶液的濃度（μg/m L），該回歸方程的線性決定系數(shù)R2=O.9954。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲波功率對紅菜苔廢棄物多酚提取的影響

圖1 超聲波功率對紅菜苔廢棄物多酚提取的影響Fig.1 Effectof ultrasonicon yield of polyphenols from Brassica campestris L.var.purpurea Baileysh waste

由圖1可以看出，隨著超聲波功率增加，紅菜苔廢棄物多酚的提取量也增加，到192W時達(dá)到最大值，超聲波功率大于192W時，隨著功率的增加，紅菜苔廢棄物多酚的提取量先明顯下降，然后緩慢升高。這表明超聲波功率過低和過高都不利于紅菜苔廢棄物多酚的提取，因此在響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)中選取192W為中點(diǎn)，在96～288W范圍內(nèi)研究超聲波與其他兩因素的互作效應(yīng)。

2.2.2 液料比對紅菜苔廢棄物多酚提取的影響 由圖2可知，當(dāng)液料比為40∶1時，紅菜苔廢棄物多酚的提取量升到比較高的水平，隨著液料比的進(jìn)一步增加，紅菜苔廢棄物多酚的提取量先略微下降，再緩慢上升，考慮到液料比越高，后續(xù)濃縮成本也越大，因此本研究選取液料比40∶1為中心點(diǎn)，分別以20∶1和60∶1為下限和上限，研究液料比與其他兩因素的互作效應(yīng)。

圖2 液料比對紅菜苔廢棄物多酚提取的影響Fig.2 Effectof liquid-solid ration on yield of polyphenols from Brassica campestris L.var.purpurea Baileysh waste

2.2.3 提取時間對紅菜苔廢棄物多酚提取的影響 由圖3可以看出，隨著提取時間的增加，紅菜苔廢棄物多酚的提取量總體上呈增加趨勢，但從提取時間20m in開始，增幅十分緩慢，考慮到從理論上講，在一定范圍內(nèi)，提取時間越長，紅菜苔廢棄物多酚的提取量應(yīng)該越高，本研究以提取時間25min為中心點(diǎn)，在10～40m in范圍內(nèi)研究提取時間與其他兩因素的互作效應(yīng)。

圖3 提取時間對紅菜苔廢棄物多酚提取的影響Fig.3 Effectof time on yield of polyphenols from Brassica campestris L.var.purpurea Baileysh waste

2.3 超聲波提取紅菜苔多酚的響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及提取的結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以超聲功率A（W）、液料比B（m L∶g）、提取時間C（m in）為參數(shù)，以紅菜苔提取液中多酚含量Y（mg/g，以沒食子酸的重量計(jì)）為指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及提取的結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table2 Design and results of response surface analysis

2.4 回歸模型的建立及方差分析

通過Design-Expert軟件對表中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合及對模型進(jìn)行方差分析，得到方差分析表（表3）以及如下回歸方程，響應(yīng)值Y為紅菜苔中多酚的提取量為（mg/g）：Y=4.34-5.371×10-3A+0.30B+0.080C+0.24AB-0.090AC-0.085BC+0.23A2+0.21ABC+0.47AB2。

該回歸方程的F值為8.19，p=0.0035＜0.01，說明回歸模型是極顯著的，該模型是有意義的；失擬項(xiàng)F= 0.084，p=0.9898＞0.05，表明失擬項(xiàng)差異不顯著，即回歸方程對所有的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)擬合的較好，不存在其他對結(jié)果產(chǎn)生顯著影響的未知因素；相關(guān)系數(shù)R2=0.9021，表明此模型擬合程度良好，響應(yīng)值變化中的有90.21%可以用所選變量來解釋，因此，該回歸方程能很好地描述并預(yù)測各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

2.5 響應(yīng)曲面交互作用分析

采用多元三次回歸方程來擬合影響因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，分析上述方程所代表的響應(yīng)曲面。根據(jù)三次方程模型做出超聲功率和液料比之間交互作用的3-D響應(yīng)曲面。從圖4可以看出，液料比的曲面起伏較大，功率曲面較平緩，等高線沿液料比軸向較功率軸向密集，說明液料比對多酚提取量的影響比功率的影響大[11]，這與表3中方差分析的結(jié)論一致；圖4呈不規(guī)則的馬鞍形，最高點(diǎn)不在曲面中央，顯示在研究所設(shè)定的范圍內(nèi)，隨著液料比和超聲波功率的增加，紅菜苔廢棄物多酚的提取量也逐漸增加。

表3 回歸模型的方差分析表Table3 The variance analysis of regressionmodel

圖4 液料比和超聲波功率對多酚提取率的影響Fig.4 Influence of liquid-solid ratio and ultrasonic powe to extraction rate of polyphenol

2.6 參數(shù)優(yōu)化與驗(yàn)證

通過Design Expert軟件中的優(yōu)化（optim ization）模塊，在上述方程基礎(chǔ)上，以紅菜苔多酚提取率最高為優(yōu)化目的，得到理論上提取紅菜苔多酚的最優(yōu)條件：超聲波功率249W，液料比52∶1，提取時間34m in。在此條件下紅菜苔多酚的理論提取量是5.69mg/g。為檢驗(yàn)優(yōu)化條件的可靠性，按照上述優(yōu)化過的工藝參數(shù)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次，實(shí)際測得紅菜苔多酚平均提取量為5.84mg/g，與理論預(yù)測值相比，預(yù)測準(zhǔn)確率為97.34%，預(yù)測值與實(shí)際驗(yàn)證值基本相符，表明該優(yōu)化提取工藝穩(wěn)定可靠。

3 結(jié)論

多酚是極性物質(zhì)，可直接使用蒸餾水作為提取劑。利用超聲波破碎紅菜苔莖皮細(xì)胞，通過響應(yīng)曲面法的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到提取紅菜苔多酚水提的最優(yōu)條件為：超聲波功率249W，液料比52∶1，提取時間34m in。在此條件下，測得紅菜苔多酚提取量為5.84mg/g，達(dá)到理論預(yù)測值的97.34%。采用優(yōu)化的提取工藝參數(shù)提取紅菜苔多酚，得率較高，能充分利用紅菜苔廢棄物，且用水作為溶劑，避免了提取過程中其他藥物對產(chǎn)品的污染，具有很大的應(yīng)用前景。

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