中華苦荬菜總黃酮超聲提取工藝研究及不同干燥方法對(duì)其得率的影響

石同同，韓麗萍，陳瑩瑩，王 頡，*，孫劍鋒，趙雪聰，張玉芬

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000；2.唐山市曹妃甸區(qū)濕地和鳥類省級(jí)自然保護(hù)管理處，河北唐山063299；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北保定071000）

中華苦荬菜（Ixeris chinensis（Thunb.ex Thunb.）Nakai）為野生綠色蔬菜，是菊科苦苣屬的一年或兩年生草本植物[1]，中華苦荬菜含有豐富的營養(yǎng)成分和生理活性物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和保健作用，也是一種藥食共用的植物[2]。中華苦荬菜藥用歷史悠久，《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本綱目》均有記載，具有清熱解毒、消腫排膿、涼血化瘓、消食和胃、清肺止咳、益肝利尿之功效[3]，臨床用于治療急性痢疾、腸炎、痔瘡腫痛等癥，藥用價(jià)值高，中國民間自古作為藥材應(yīng)用。中華苦荬菜在我國分布廣泛，野生資源豐富，食用、藥用歷史悠久，其化學(xué)成分及藥理作用復(fù)雜[4-5]。中華苦荬菜中主要含有黃酮、倍半萜內(nèi)酯、三萜類化合物以及香豆素等活性成分[6-7]，而黃酮類活性成分具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、防止心血管疾病的發(fā)生以及降血脂等保健作用[8-9]。

常用提取總黃酮的方法有煎煮法、回流法、浸漬法，這幾種方法具有提取時(shí)間長、提取率低且總黃酮等活性成分損失量大等缺點(diǎn)。超聲波破碎細(xì)胞提取法是近幾年新興的一種提取方法，具有選擇性高、提取時(shí)間短、提取率高、消耗溶劑少等優(yōu)點(diǎn)[10-12]，本實(shí)驗(yàn)采用正交優(yōu)化法確定中華苦荬菜總黃酮超聲提取最佳條件，并對(duì)真空冷凍干燥、紅外干燥、自然陰干、烘干及自然曬干的的中華苦荬菜總黃酮得率進(jìn)行測(cè)定，為中華苦荬菜資源的更好的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中華苦荬菜 采自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，經(jīng)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科技學(xué)院馮大嶺教授鑒定為中華苦荬菜，50℃條件下烘干至恒重，粉碎后過40目，真空密封備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國食品藥品檢定研究院，供UV法測(cè)定含量為92.5%；95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 市售分析純。

kq-500de型細(xì)胞超聲破碎儀 昆山市超聲儀器有限公司；WFZ-UV-2800型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼科儀器有限公司；LG-1.5型真空冷凍干燥機(jī) 沈陽航天新陽速凍設(shè)備有限公司；HW-3型紅外干燥箱 天津市拓普儀器有限公司；DL-101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱箱 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；TB-215D型分析天平 賽多利斯股份有限公司，德國：感量為十萬分之一。

1.2 中華苦荬菜處理方法

新鮮中華苦荬菜洗凈，50℃條件下烘干至恒重，粉碎后過40目，準(zhǔn)確稱取中華苦荬菜干粉2.000g，放入一定體積的乙醇溶液，放入超聲波破碎儀固定功率600W，提取后抽濾，抽濾液用60%乙醇定容到50m L容量瓶得到中華苦荬菜提取液，精密稱取實(shí)驗(yàn)中抽濾后的中華苦荬菜提取液2m L置于25m L容量瓶中，加入1m L濃度5%NaNO2，振蕩搖勻后放置5min，再加入1m L濃度10%Al（NO3）3，振蕩搖勻后放置5min，再加入4m L 4%NaOH，用60%乙醇定容，搖勻后放置15m in后在波長為510nm下測(cè)定吸光值。

1.3 中華苦荬菜中總黃酮的確定

對(duì)按1.2方法提取的中華苦荬菜提取液在200～800nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果表明提取液在510nm左右有最大吸收峰，而蘆丁的最大吸收峰也是在510nm左右，因此可以用蘆丁含量來反應(yīng)總黃酮含量。

1.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取120℃干燥12h的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.01080g，置于50m L容量瓶中，以60%的乙醇溶解并定容，得到濃度為0.216mg/m L的標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)液0、1、2、3、4、5m L于25m L的容量瓶中，加入1m L濃度5%NaNO2，振蕩搖勻后放置5m in，再加入1m L濃度10%A l（NO3）3，振蕩搖勻后放置5m in，再加入4m L 4% NaOH，用60%乙醇定容，搖勻后放置15m in后以第一瓶做空白在波長為510nm下測(cè)定。

1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響 精確稱取中華苦荬菜粉末2.000g，在料液比1∶20，提取時(shí)間1h條件下，分別加入濃度為30%、45%、60%、75%、95%的乙醇溶液，進(jìn)行超聲破碎提取1h后，按照1.2方法進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算總黃酮得率。

1.5.1.2 超聲提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 精確稱取中華苦荬菜粉末2.000g，在料液比1∶20，乙醇濃度為60%的條件下，分別提取15、30、45、60、75、90m in，按照1.2方法進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算總黃酮得率。

1.5.1.3 料液比對(duì)總黃酮得率的影響 精確稱取中華苦荬菜粉末2.000g，在乙醇濃度為60%的條件下提取1h，分別考察料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/m L）對(duì)中華苦荬菜總黃酮得率的影響。按照1.2方法進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算總黃酮得率。

李治邦，男，1953年5月出生于天津，河北省安平縣人。1970年入伍，1978年轉(zhuǎn)業(yè)到天津市群眾藝術(shù)館工作，現(xiàn)任館長、研究館員，任天津市非物質(zhì)文化遺產(chǎn)保護(hù)中心主任。1977年開始發(fā)表作品，已出版長篇小說《逃出孤獨(dú)》《城市獵人》兩部，中篇小說六十多部，短篇小說一百多篇。與人合作的電視連續(xù)劇《蒼茫》獲中宣部“五個(gè)一工程獎(jiǎng)”，話劇《希望之星》獲文化部“群星獎(jiǎng)”銀獎(jiǎng)，廣播劇《咱們工人》獲全國廣播劇“政府獎(jiǎng)”銀獎(jiǎng)。中國作家協(xié)會(huì)會(huì)員。

1.5.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在中華苦荬菜總黃酮提取單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)其總黃酮得率主要的影響因素乙醇濃度、超聲提取時(shí)間、料液比進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，確定中華苦荬菜總黃酮的最佳提取條件。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平表Table1 Factors and levels of orthogonal test

1.6 用不同干燥方法對(duì)中華苦荬菜進(jìn)行處理工藝條件

1.6.1 真空冷凍干燥 將采集的中華苦荬菜全草洗凈，放入真空冷凍干燥機(jī)的冷凍室，迅速降溫至-40℃，保持1h。再將凍結(jié)的中華苦荬菜放入真空干燥室，干燥8h，至樣品質(zhì)量不再發(fā)生改變，取出凍干的中華苦荬菜粉碎后過40目，抽真空包裝后備用。

1.6.2 紅外干燥 將采集的中華苦荬菜全草洗凈放入HW-3型紅外干燥箱，干燥2h，干燥結(jié)束后取出粉碎后過40目，抽真空包裝后備用。

1.6.3 陰干 將采集的中華苦荬菜全草洗凈，放置到背陰處，48h后干燥結(jié)束，將陰干的中華苦荬菜粉碎后過40目，抽真空包裝后備用。

1.6.4 烘干 將采集的中華苦荬菜全草洗凈，50℃條件下烘干至恒重，粉碎后過40目，抽真空包裝后備用。

1.6.5 曬干 將采集的中華苦荬菜全草洗凈，從上午8點(diǎn)到下午6點(diǎn)放到陽臺(tái)上曬干，10h后質(zhì)量不再發(fā)生變化，干燥結(jié)束后粉碎后過40目，抽真空包裝后備用。

1.7 總黃酮得率的計(jì)算

式中，Z為總黃酮得率，%；C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出來的所測(cè)樣品液的總黃酮濃度，μg/m L；625為所測(cè)樣品液的體積，m L；2×1000×1000為中華苦荬菜樣品的質(zhì)量，μg。

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，顯著水平p＜0.01差異極顯著，p＜0.05差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)蘆丁不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液得到的吸光度。以吸光度（y）為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明在蘆丁濃度為0～41.2μg/m L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。如圖1所示，回歸方程為y=0.0120x-0.0058，R2=0.9990。

2.2 超聲提取總黃酮單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。從圖2可知，隨著乙醇濃度的增大，總黃酮得率逐漸升高，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，總黃酮的得率最大，總得率為1.32%；乙醇濃度的繼續(xù)增大，總黃酮得率開始下降，主要原因可能是隨著乙醇濃度的不斷增大，溶液的極性逐漸增大，而中華苦荬菜中總黃酮成分的極性是基本恒定的，根據(jù)相似相容原理，當(dāng)乙醇濃度增大到60%時(shí)，如果繼續(xù)增大乙醇濃度，則提取液中因?yàn)樗畼O性增大導(dǎo)致提取率開始下降，從而使總黃酮得率降低。

圖2 乙醇濃度對(duì)得率的影響Fig.2 Effects of alcohol concentration on extraction rate

2.2.2 超聲提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。從圖3可知，隨著超聲提取時(shí)間的增加，總黃酮得率逐漸升高，當(dāng)超聲提取45m in時(shí)，中華苦荬菜總黃酮得率達(dá)到最大，此時(shí)得率為1.29%。當(dāng)提取時(shí)間超過45m in時(shí)，總黃酮得率趨于穩(wěn)定，這可能是超聲提取時(shí)間過長，導(dǎo)致中華苦荬菜細(xì)胞組織的破壞，使一些不溶性的雜質(zhì)溢出，從而阻止了總黃酮成分的溶出。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.3 Effects of processing time on extraction rate

2.2.3 料液比對(duì)總黃酮得率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。從圖4可知，隨著溶液量的逐漸增大，中華苦荬菜總黃酮得率逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，總得率達(dá)到最大，為1.33%。當(dāng)繼續(xù)增大溶液量，總黃酮的得率變化不大。分析原因可能是由于在超聲波的作用下，中華苦荬菜中所含黃酮類物質(zhì)已經(jīng)最大限度溶出，當(dāng)料液比進(jìn)一步增大時(shí)導(dǎo)致且其他雜質(zhì)進(jìn)入浸提液，從而阻止了總黃酮成分的溶出。

圖4 料液比對(duì)得率影響Fig.4 Effects ofmaterial-liquid ratio on extraction rate

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，擬選用超聲提取時(shí)間（A），乙醇濃度（B），料液比（C）等三個(gè)因素作為考察指標(biāo)，各因素水平設(shè)置如表1所示，正交實(shí)驗(yàn)采用四因素三水平實(shí)驗(yàn)即L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

采用極差法對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，由表2的R值可知，影響中華苦荬菜總黃酮得率的因素依次為C＞B＞A，即料液比＞乙醇濃度＞超聲時(shí)間。最佳提取條件為A3B2C3，即在濃度為60%乙醇，料液比1∶20（g/m L）的條件下，提取60m in。

方差分析見表3，結(jié)果顯示，料液比對(duì)中華苦荬菜總黃酮提取率有極顯著影響（p＜0.01），而超聲提取時(shí)間與乙醇濃度則均未達(dá)到顯著水平（p＞0.05）。

表2 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of orthogonal test

表3 方差分析表Table3 Analysis of extraction rate of flavonoids

2.4 最佳提取條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在擬選定的最佳提取條件A3B2C3下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所提取的總黃酮得率平均值為1.34%，大于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的得率。故認(rèn)為此正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳提取工藝條件是可靠的，且該工藝穩(wěn)定可行。

2.5 不同干燥方法干燥的中華苦荬菜總黃酮得率測(cè)定

按照中華苦荬菜總黃酮的最佳超聲提取條件，分別測(cè)定真空冷凍干燥、紅外干燥、陰干、烘干以及曬干的中華苦荬菜中總黃酮得率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 干燥方式對(duì)得率的影響Fig.5 Effects of dryingmethods on extraction rate

真空冷凍干燥方式中的中華苦荬菜總黃酮得率最高，為3.75%，曬干的中華苦荬菜總黃酮得率最低，為0.74%，干燥效果依次為凍干＞紅外干燥＞陰干＞烘干＞曬干。由此可知，直射光線對(duì)總黃酮得率的影響非常大，容易使總黃酮含量因氧化而使得率降低。真空冷凍干燥中華苦荬菜在干燥前始終處于低溫（凍結(jié)狀態(tài)），同時(shí)冰晶均勻分布于中華苦荬菜中，升華過程不會(huì)因脫水而發(fā)生濃縮現(xiàn)象，避免了由水蒸氣產(chǎn)生泡沫、總黃酮的氧化等副作用，因此真空冷凍干燥方式所得的總黃酮得率最高。紅外干燥中華苦荬菜內(nèi)部水分的濕擴(kuò)散與熱擴(kuò)散方向是一致的，從而也就加速了水分內(nèi)擴(kuò)散的過程，也即加速了中華苦荬菜的干燥進(jìn)程，因此短時(shí)間內(nèi)就可干燥結(jié)束中華苦荬菜，從而避免總黃酮含量的降低。但是考慮到真空冷凍干燥方式存在能耗高，干燥時(shí)間長等缺點(diǎn)，而紅外干燥具有干燥效率高，活性成分損失少等優(yōu)點(diǎn)，因此建議生產(chǎn)上采用紅外干燥的方式，同樣能得到較高的總黃酮含量。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交實(shí)驗(yàn)確定了最佳中華苦荬菜總黃酮超聲提取的最佳提取工藝條件為：超聲提取時(shí)間60min，乙醇濃度60%，料液比1∶20。此時(shí)總黃酮得率可達(dá)1.34%。用最佳提取條件分別對(duì)真空冷凍干燥、紅外干燥、自然陰干、烘干及自然曬干的中華苦荬菜中的總黃酮得率進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明真空冷凍干燥的中華苦荬菜總黃酮得率最高，為3.75%，曬干的中華苦荬菜總黃酮得率最低，為0.74%，不同干燥方式得率的大小依次為凍干（3.75%）＞紅外干燥（2.84%）＞陰干（1.56%）＞烘干（1.34%）＞曬干（0.74%）。

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