魷魚(yú)內(nèi)臟水解液美拉德反應(yīng)條件優(yōu)化及反應(yīng)前后氨基酸組成的變化

張慧芳，李婷婷，勵(lì)建榮，*，李學(xué)鵬，董志儉

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州121013；2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600）

隨著水產(chǎn)品加工業(yè)的快速發(fā)展，不同種類的魷魚(yú)產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)，由此而產(chǎn)生大量的加工下腳料，其中魷魚(yú)內(nèi)臟約占15.92%[1]。這類副產(chǎn)物大都用來(lái)加工魚(yú)粉，還有部分甚至被當(dāng)作廢物隨意丟棄或掩埋。魷魚(yú)內(nèi)臟營(yíng)養(yǎng)豐富，每100g魷魚(yú)內(nèi)臟中含脂肪21.15g，蛋白質(zhì)21.24g，鈣51.46mg，鐵609.07μg和磷95.88μg[1]。此外，魷魚(yú)內(nèi)臟水解液中還含有18種氨基酸（包括全部人體必需氨基酸），魷魚(yú)內(nèi)臟油脂脂肪酸中含10.58%的EPA和15.23%的DHA，非常值得開(kāi)發(fā)研究[2]。目前利用魷魚(yú)內(nèi)臟提取魚(yú)油、生產(chǎn)海味素、加工魷魚(yú)醬油等已有報(bào)道[3-6]。

美拉德反應(yīng)在食品加工過(guò)程中可以使本來(lái)不具備顏色和香味的物質(zhì)通過(guò)混合反應(yīng)產(chǎn)生不同程度的褐色和香味。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有抗氧化作用[7]，尤其是一些含有氨基還原酮結(jié)構(gòu)的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物[8-11]。以魷魚(yú)內(nèi)臟的酶解液為基料，通過(guò)Maillard反應(yīng)制備天然健康的海鮮調(diào)味料對(duì)于拓寬魷魚(yú)內(nèi)臟的應(yīng)用范圍，提升其價(jià)值具有重要意義。本文以魷魚(yú)內(nèi)臟酶解液為基料，通過(guò)美拉德反應(yīng)制備風(fēng)味產(chǎn)物，并探索葡萄糖、pH、溫度及時(shí)間等因素對(duì)美拉德產(chǎn)物風(fēng)味的影響，研究美拉德反應(yīng)前后氨基酸組分的變化情況，旨在為制備營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味濃郁的海鮮風(fēng)味調(diào)味料提供技術(shù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魷魚(yú)（阿根廷魷魚(yú)） 市售；中性蛋白酶500LAPU/g，諾維信公司；葡萄糖、檸檬酸 均為食品級(jí)。

PB-10型pH計(jì) 賽多利斯公司；賽康BL301B3絞肉機(jī) 上海賽康電器有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司；日立L-8900型氨基酸全自動(dòng)分析儀日立高新技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶解液制備 將魷魚(yú)內(nèi)臟（含水量70%）和水按1∶1混合，置于酶反應(yīng)器中，攪拌器不停攪拌，在自然pH、45℃下加1%中性蛋白酶反應(yīng)4h，4500r/min離心20m in后取上清液[12]。

1.2.2 美拉德產(chǎn)物的制備 在錐形瓶中加入10m L的上述酶解液，加入占酶解液一定質(zhì)量的葡萄糖攪拌均勻，用0.1mol/L NaOH溶液和10%的檸檬酸溶液調(diào)至一定pH，封口置于一定溫度的水浴鍋中反應(yīng)一定時(shí)間后取出，流水冷卻。

1.2.2.1 pH對(duì)魷魚(yú)內(nèi)臟水解液美拉德產(chǎn)物風(fēng)味的影響 將酶解液的pH分別調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，葡萄糖加入量為1.5%，在100℃反應(yīng)60m in。進(jìn)行感官評(píng)定。

1.2.2.2 時(shí)間對(duì)魷魚(yú)內(nèi)臟水解液美拉德產(chǎn)物風(fēng)味的影響 將酶解液pH調(diào)至8.0，在100℃，葡萄糖加入量為1.5%，分別反應(yīng)30、40、50、60、70m in。進(jìn)行感官評(píng)定。

1.2.2.3 溫度對(duì)魷魚(yú)內(nèi)臟水解液美拉德產(chǎn)物風(fēng)味的影響 將酶解液pH調(diào)至8.0，葡萄糖加入量為1.5%，在80、85、90、95、100℃反應(yīng)50m in。

1.2.2.4 葡萄糖添加量對(duì)魷魚(yú)內(nèi)臟水解液美拉德產(chǎn)物風(fēng)味的影響 將酶解液pH調(diào)至8.0，葡萄糖添加量分別0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，在100℃反應(yīng)50m in。

1.2.2.5 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果，對(duì)反應(yīng)pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和葡萄糖添加量進(jìn)行四因素三水平的正交優(yōu)化。

表1 四因素三水平正交優(yōu)化表Table1 Orthogonal optimization of four factors and three levels

1.2.3 感官評(píng)定 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)定方法：評(píng)分檢驗(yàn)法[13]。采用9點(diǎn)快感標(biāo)度測(cè)定法對(duì)樣品進(jìn)行總體風(fēng)味接受性測(cè)定，以腥味、肉香味、海鮮味、香甜味、烤香味、焦糊味、苦味、咸味以及色澤為評(píng)價(jià)指標(biāo)，由10人組成的評(píng)價(jià)小組對(duì)每個(gè)樣品的總體接受性按照9點(diǎn)快感標(biāo)度測(cè)定法評(píng)分，對(duì)每個(gè)樣品按0～9打分，9=極喜歡，8=非常喜歡，7=喜歡，6=較喜歡，5=一般，4=較不喜歡，3=不喜歡，2=非常不喜歡，1=極不喜歡，結(jié)果取平均值。

1.2.4 氨基酸組分分析 利用氨基酸自動(dòng)分析儀分析美拉德反應(yīng)前、后氨基酸組分變化情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)化美拉德反應(yīng)條件

2.1.1 pH對(duì)美拉德產(chǎn)物感官風(fēng)味的影響 體系pH對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物種類的影響至關(guān)重要，其影響是通過(guò)羰基和氨基在不同pH環(huán)境中可進(jìn)行不同程度的離子化來(lái)實(shí)現(xiàn)的[14]。當(dāng)pH大于7時(shí)，Amadori重排的結(jié)果產(chǎn)生了還原酮，如4-羥基-5-甲基-2，3-二氫呋喃-3酮（HMFone）和一些諸如丙酮醇、丙酮醛和雙乙酰的產(chǎn)物，這些物質(zhì)進(jìn)一步參與美拉德反應(yīng)[15]。如圖1所示，當(dāng)pH5～8時(shí)，隨著pH的增加，感官評(píng)分隨之增加，原腥味逐漸減弱，鮮味逐漸增強(qiáng)，樣品顏色由淡黃色不斷加深。當(dāng)pH9時(shí)，感官評(píng)分降低，可能由于美拉德反應(yīng)劇烈，產(chǎn)生焦糊味。這說(shuō)明pH過(guò)低和過(guò)高都不利于美拉德反應(yīng)風(fēng)味物質(zhì)的形成，但偏堿性的環(huán)境有利于美拉德反應(yīng)的進(jìn)行。由感官評(píng)分可知，pH為8時(shí)美拉德產(chǎn)物感官風(fēng)味較好。

圖1 不同pH值對(duì)水解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官評(píng)分的影響Fig.1 Effects of pH on the sensory evaluation of Maillard reaction products

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)美拉德產(chǎn)物感官風(fēng)味的影響 如圖2所示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為30min時(shí)，感官評(píng)分較低，原腥味較重，可能是由于反應(yīng)不徹底，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，氨基酸和還原糖不斷反應(yīng)，產(chǎn)物風(fēng)味逐漸增強(qiáng)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為50m in時(shí)，感官評(píng)分最高，產(chǎn)物風(fēng)味最濃郁。但是當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)50min時(shí)，產(chǎn)物明顯地產(chǎn)生其他雜味和焦糊味。這說(shuō)明反應(yīng)時(shí)間對(duì)美拉德反應(yīng)同樣很重要，反應(yīng)時(shí)間太短，反應(yīng)不完全，而反應(yīng)時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)產(chǎn)生一些不良?xì)馕?。由感官評(píng)分可知，反應(yīng)時(shí)間為50m in時(shí)美拉德產(chǎn)物感官風(fēng)味較好。

圖2 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官評(píng)分的影響Fig.2 Effects of time on the sensory evaluation of Maillard reaction products

2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)美拉德產(chǎn)物感官風(fēng)味的影響 美拉德反應(yīng)是一個(gè)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，溫度的高低會(huì)使反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)沿著不同的反應(yīng)支路而生成不同的風(fēng)味，因此溫度對(duì)美拉德反應(yīng)中風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要影響[16]。有研究表明，80～120℃范圍內(nèi)，褐變速率會(huì)隨著溫度的上升而加快，超過(guò)120℃后，褐變速率又會(huì)趨于平緩[17]。本次實(shí)驗(yàn)選取的溫度范圍是80～100℃。如圖3所示，溫度在80～100℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，產(chǎn)物的感官綜合評(píng)分也不斷的增加，產(chǎn)物原腥味逐漸減少，顏色由淡黃色逐漸加深?？赡苁怯捎跍囟鹊纳邥?huì)增加糖和氨基酸組分的反應(yīng)活性，產(chǎn)生大量的揮發(fā)物質(zhì)。由感官評(píng)分可知，反應(yīng)溫度為100℃時(shí)美拉德產(chǎn)物感官風(fēng)味較好。

圖3 不同反應(yīng)溫度對(duì)水解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官評(píng)分的影響Fig.3 Effects of reaction temperature on the sensory evaluation ofMaillard reaction products

2.1.4 葡萄糖添加量對(duì)美拉德產(chǎn)物感官風(fēng)味的影響

葡萄糖是美拉德反應(yīng)的必要條件之一，葡萄糖的添加量必然會(huì)對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)生影響。如圖4所示，當(dāng)葡萄糖添加量為0.5%時(shí)，產(chǎn)物感官評(píng)分較低，原腥味較重，隨著葡萄糖添加量的增加，感官評(píng)分隨之增高，當(dāng)葡萄糖添加量為1.5%時(shí)，感官評(píng)分值達(dá)到最高，反應(yīng)產(chǎn)物香味濃郁，且容易辨別，美拉德反應(yīng)適中；當(dāng)葡萄糖添加量繼續(xù)增加時(shí)，可能發(fā)生焦糖化反應(yīng)，感官評(píng)分逐漸下降，產(chǎn)物風(fēng)味也較差，雜味重。由感官評(píng)分可知，葡萄糖添加量為1.5%時(shí)美拉德產(chǎn)物感官風(fēng)味較好。

圖4 不同葡萄糖添加量對(duì)水解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官評(píng)分的影響Fig.4 Effects of glucose dose on the sensory evaluation of Maillard reaction products

2.1.5 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化美拉德反應(yīng)條件 從表2數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析，影響反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味評(píng)分的重要程度依次是：pH=溫度＞時(shí)間=葡萄糖添加量，即pH及溫度對(duì)產(chǎn)物風(fēng)味的影響最大，葡萄糖添加量對(duì)產(chǎn)物風(fēng)味的影響最小；最佳反應(yīng)條件為：pH 7.5、時(shí)間45m in、溫度95℃、葡萄糖添加量1.5%；由方差分析表3可知pH、溫度、時(shí)間和葡萄糖添加量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有差異但并不顯著。

表2 四因素三水平正交優(yōu)化結(jié)果Table2 Results of the orthogonal optimization of four factors and three levels

表3 方差分析表Table3 Analysis of variance

2.2 美拉德反應(yīng)前后氨基酸組分分析

表4 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中主要氨基酸的組成變化Table4 Changes of themain amino acids component in the Maillard reaction products

美拉德反應(yīng)前水解液和反應(yīng)后產(chǎn)物的氨基酸組成如表4所示。氨基酸減少比例較明顯的主要有：組氨酸（86.71%）、脯氨酸（39.11%）、精氨酸（16.18%）、苯丙氨酸（15.96%），說(shuō)明這幾種氨基酸是參與該美拉德反應(yīng)產(chǎn)香味的主要氨基酸。另外，魷魚(yú)內(nèi)臟水解液中含有較多的鮮味物質(zhì)谷氨酸，且美拉德反應(yīng)后僅減少5.88%，這對(duì)利用水解液進(jìn)行美拉德反應(yīng)制備鮮味調(diào)料有重要的意義。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)比較了不同pH、不同時(shí)間、不同溫度和不同葡萄糖添加量對(duì)魷魚(yú)內(nèi)臟酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味的影響，并利用正交實(shí)驗(yàn)獲得最佳的美拉德反應(yīng)條件為：葡萄糖添加量1.5%、反應(yīng)溫度95℃、pH7.5、反應(yīng)時(shí)間45min。

通過(guò)比較水解液美拉德反應(yīng)前、后氨基酸的組成及變化情況，發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)后氨基酸含量普遍降低；變化較明顯的氨基酸是組氨酸、脯氨酸、精氨酸以及苯丙氨酸，說(shuō)明這幾種氨基酸可能是參與該美拉德反應(yīng)產(chǎn)香味的主要氨基酸；鮮味氨基酸天冬氨酸和谷氨酸的損失較小，必需氨基酸總含量較高，具有良好的營(yíng)養(yǎng)性。

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