響應(yīng)面優(yōu)化酶法輔助提取金針菇根部多糖的工藝研究

陳貴堂，趙立艷，劉 瑋，李 博，綦國(guó)紅，王歲樓

（1.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210009；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095）

金針菇（Flammunlina velutipes）為擔(dān)子菌綱傘菌目金錢菌屬，是一種藥食兩用菌，其子實(shí)體含有豐富的多糖、氨基酸和多種維生素（VB1、VB2、VC、Vpp）[1-3]。其中金針菇多糖是金針菇中主要的生物活性成分之一，具有清除自由基、增強(qiáng)記憶力、抑制腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種生物學(xué)作用[4-9]。隨著人們對(duì)金針菇營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的認(rèn)識(shí)，金針菇的消費(fèi)量越來(lái)越高。同時(shí)，產(chǎn)生的金針菇菌柄基部（俗稱金針菇根）也越來(lái)越多。由于金針菇根中纖維素等成分較多，口感較差，以致售賣前或食用前人們就將其剪下丟棄，造成極大浪費(fèi)。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)金針菇功能成分的研究主要集中在其子實(shí)體和菌絲體上[10-13]，而針對(duì)金針菇菌柄基部的研究還鮮有報(bào)道?？梢?jiàn)，作為一種可再利用資源，如何提高其生產(chǎn)附加值，對(duì)其中的多糖類化合物等功能成分進(jìn)行相關(guān)研究具有重要意義，而多糖的提取是多糖研究的關(guān)鍵步驟，也是基礎(chǔ)步驟。多糖的提取方法將直接影響到多糖的得率、結(jié)構(gòu)和活性。目前常用的多糖提取方法有熱水浸提法、酸浸提法、堿浸提法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法以及酶輔助提取法等，其中酶輔助提取法是近年來(lái)流行的一種新型多糖提取方法，具有條件溫和、雜質(zhì)易除和得率高等優(yōu)點(diǎn)，得到了廣泛應(yīng)用[14-17]，但利用酶法輔助提取金針菇菌根的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本文從有效利用金針菇原材料和生產(chǎn)的角度出發(fā)，以金針菇菌柄基部為研究對(duì)象，以水為提取介質(zhì)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化了金針菇菌柄基部多糖的酶法輔助提取工藝，確定其最佳工藝參數(shù)，旨在為金針菇菌柄基部多糖的提取純化和生物活性研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮金針菇 購(gòu)自江蘇南京市場(chǎng)，取其根部，50℃真空干燥，粉碎，過(guò)80目篩備用；纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶（酶活均為200U/mg） 北京康倍斯科技有限公司；葡萄糖、氫氧化鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸、乙醇 南京化學(xué)試劑有限公司；苯酚 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白 美國(guó)Sigma公司；其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水 為蒸餾水。

TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；DZF-6050MBE真空干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；FW-177中草藥粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；XJ-ⅡB離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖含量的測(cè)定 多糖的含量采用苯酚-硫酸法[18]進(jìn)行測(cè)定。

多糖提取率（%）=提取液中多糖總質(zhì)量（g）/樣品質(zhì)量（g）×100

1.2.2 金針菇根部多糖提取方法的篩選 一般來(lái)說(shuō)，食用菌細(xì)胞壁主要由纖維素和果膠類物質(zhì)構(gòu)成，并且含有較多的蛋白質(zhì)，故選取纖維素酶、木瓜蛋白酶和果膠酶在酶添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分別為2%、料液比1∶20及其各自廠家推薦最適作用溫度和pH條件下酶解金針菇菌根細(xì)粉60m in，然后繼續(xù)在90℃條件下提取120min，分別考察提取體系中酶的種類對(duì)多糖提取率的影響，并以多糖提取率為指標(biāo)，將不同酶解方法與熱水浸提法進(jìn)行比較，具體方法如下。

準(zhǔn)確稱取12份樣品，每份10g，加入200m L蒸餾水，分為4組進(jìn)行提取，分別為常規(guī)水提法（50℃溫水浸泡60m in，然后90℃熱水浸提120m in）、纖維素酶輔助提?。ㄌ砑恿?%，pH 4.5，45℃處理60m in，然后再用90℃熱水浸提120m in）、木瓜蛋白酶輔助提?。ㄌ砑恿?%，pH4.5，50℃處理60min，然后再用90℃熱水浸提120m in）和果膠酶輔助提?。ㄌ砑恿?%，pH 3.5，50℃處理60m in，然后再用90℃熱水浸提120m in），測(cè)定提取液的多糖含量，通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)選擇適宜的提取方法，并對(duì)該方法進(jìn)行單因素與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

1.2.3 金針菇根部多糖提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn) 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察酶添加量、液料比、酶解pH、酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)金針菇根部多糖提取率的影響。酶解時(shí)將反應(yīng)容器置于全溫振蕩培養(yǎng)箱中，轉(zhuǎn)速設(shè)定為120r/min。酶解提取反應(yīng)完成后將反應(yīng)容器放入90℃水浴中持續(xù)120m in，待液料冷卻后通過(guò)離心進(jìn)行汁渣分離。

1.2.3.1 酶添加量對(duì)多糖提取率的影響 固定料液比1∶20、酶解溫度50.0℃、酶解pH 5.0、酶解時(shí)間60m in，調(diào)節(jié)木瓜蛋白酶添加量分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，酶解60min，測(cè)定多糖提取率。

1.2.3.2 料液比對(duì)多糖浸提率的影響 準(zhǔn)確稱取10g樣品數(shù)份，分別按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至5.0，升溫至50℃，加入0.15g木瓜蛋白酶（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%），酶解60min，測(cè)定多糖提取率。

1.2.3.3 pH對(duì)多糖提取率的影響 準(zhǔn)確稱取10g樣品數(shù)份，固定料液比為1∶20、酶解溫度50℃、酶添加量1.5%，分別調(diào)節(jié)pH至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，酶解60m in，測(cè)定多糖提取率。

1.2.3.4 酶解溫度對(duì)多糖浸提率的影響 準(zhǔn)確稱取10g樣品數(shù)份，固定料液比為1∶20、酶添加量1.5%、酶解pH5.0，分別升溫至40、45、50、55、60、65℃，酶解60m in，測(cè)定多糖提取率。

1.2.3.5 酶解時(shí)間對(duì)多糖浸提率的影響 準(zhǔn)確稱取10g樣品數(shù)份，固定料液比1∶20、酶添加量1.5%、酶解pH5.0、酶解溫度50℃，分別酶解40、60、80、100、120、140、160m in，測(cè)定多糖提取率。

1.2.4 金針菇根部多糖提取工藝的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取影響金針菇根部多糖提取率的主要因素酶解pH、酶解溫度和酶解時(shí)間為實(shí)驗(yàn)因素，以多糖提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，其他工藝條件為料液比1∶20、木瓜蛋白酶酶添加量1.5%。實(shí)驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素和水平編碼值Table1 Codes and levels of factors in Box-Behnken design

1.2.5 回歸模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照Design Expert 7.0給出的最優(yōu)參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，計(jì)算實(shí)驗(yàn)值與理論值之間的誤差。

1.2.6 最優(yōu)提取條件下多糖的得率和純度以及蛋白質(zhì)含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取10g樣品6份，分別在傳統(tǒng)熱水提取條件下和最優(yōu)酶解參數(shù)下輔助熱水提取，提取液4000r/m in離心后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/5，加入3倍體積的無(wú)水乙醇，過(guò)夜。沉淀經(jīng)無(wú)水乙醇和丙酮洗滌后，干燥得粗多糖，稱重，計(jì)算多糖得率。并用苯酚-硫酸法測(cè)定粗多糖中的多糖質(zhì)量，計(jì)算粗多糖純度，用考馬斯亮藍(lán)染色法[19]測(cè)定粗多糖中蛋白質(zhì)的含量。

多糖得率（%）=粗多糖質(zhì)量（g）/樣品質(zhì)量（g）×100

多糖純度（%）=粗多糖中多糖質(zhì)量（g）/粗多糖質(zhì)量（g）×100

蛋白質(zhì)含量（%）=粗多糖中蛋白質(zhì)質(zhì)量（g）/粗多糖質(zhì)量（g）×100

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 響應(yīng)曲面模型的回歸方程式和顯著性統(tǒng)計(jì)通過(guò)Design Expert軟件進(jìn)行計(jì)算和分析處理，系數(shù)的顯著性通過(guò)Student t檢驗(yàn)和p值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對(duì)多糖提取率的影響

不同提取方法對(duì)金針菇根部多糖的提取效果如圖1所示。由圖1并結(jié)合數(shù)據(jù)分析可知，不同提取方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較中，木瓜蛋白酶處理的樣品多糖提取率顯著高于其他方法（p＜0.05），且是傳統(tǒng)熱水浸提法的1.9倍（p＜0.01）。說(shuō)明木瓜蛋白酶是輔助提取金針菇根部多糖的最佳用酶，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選用木瓜蛋白酶作為提取多糖的酶試劑。

圖1 不同提取方法對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effectof enzymes on the yield of polysaccharide

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶添加量對(duì)多糖提取率的影響 酶添加量對(duì)多糖提取率的影響如圖2所示。由圖2并結(jié)合數(shù)據(jù)分析可知，酶添加量從1%增加到1.5%，多糖的提取率略有增大；當(dāng)加酶量大于1.5%時(shí)，隨著酶添加量的增加，多糖提取率的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明在該底物濃度下，酶濃度已經(jīng)趨于飽和，繼續(xù)增加酶用量，對(duì)多糖提取率沒(méi)有顯著影響。因此，在本實(shí)驗(yàn)條件下，金針菇根部多糖酶法輔助提取的最適酶添加量為底物的1.5%。

圖2 酶添加量對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effectof enzyme concentration on the yield of polysaccharide

2.2.2 料液比對(duì)多糖浸提率的影響 不同料液比對(duì)多糖提取率的影響如圖3所示。由圖3并結(jié)合數(shù)據(jù)分析可知，料液比在1∶10到1∶50范圍內(nèi)，多糖提取率變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)條件下，料液比對(duì)金針菇根部多糖的提取率影響不顯著，本實(shí)驗(yàn)選取液料比為1∶20。

圖3 液料比對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effectof the ratio ofmaterial towater on the yield of polysaccharide

2.2.3 pH對(duì)多糖提取率的影響 不同pH對(duì)多糖提取率的影響結(jié)果如圖4所示。由圖4并結(jié)合數(shù)據(jù)分析可知，pH對(duì)金針菇根部多糖的提取率影響顯著，在pH4.0～6.5范圍內(nèi)，多糖提取率變化較大，呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，且pH為5.5時(shí)，多糖提取率最高。

圖4 酶解pH對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis pH on the yield of polysaccharide

2.2.4 酶解溫度對(duì)多糖浸提率的影響 酶解溫度對(duì)多糖浸提率的影響結(jié)果如圖5所示。可知，溫度在40～50℃范圍內(nèi)，多糖提取率逐漸上升，在50℃時(shí)達(dá)到最高；溫度在50～65℃范圍內(nèi)，多糖浸提率隨著溫度升高呈逐漸下降趨勢(shì)?？芍疳樄礁慷嗵悄竟系鞍酌篙o助提取的最適溫度為50℃。

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)多糖浸提率的影響 酶解時(shí)間對(duì)多糖浸提率的影響如圖6所示。由圖6并結(jié)合數(shù)據(jù)分析可知，酶解時(shí)間在20～80min的范圍內(nèi)，多糖提取率隨時(shí)間的增加迅速上升，80m in時(shí)達(dá)到最高，之后變化開始不明顯，可見(jiàn)，金針菇根部多糖木瓜蛋白酶輔助提取的最適時(shí)間為80m in。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2 擬合模型的建立與模型方差分析 對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到自變量與金針菇根部多糖提取率（Y）的二次多項(xiàng)回歸方程為：

圖5 酶解溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.5 Effectof hydrolysis temperature on the yield of polysaccharide

圖6 酶解時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.6 Effectof hydrolysis time on the yield of polysaccharide

式中，Y為多糖提取率（%）；X1為pH；X2為酶解溫度（℃）；X3為酶解時(shí)間（min）。

對(duì)模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。分析結(jié)果表明，對(duì)金針菇根部多糖提取率所建立的二次多項(xiàng)式模型具有高度顯著性（p＜0.0001），方程負(fù)相關(guān)系數(shù)的平方（R2）為0.9881，失擬項(xiàng)不顯著（p=0.1120），R= 0.9727，說(shuō)明建立的模型能夠解釋97.27%響應(yīng)值的變化，能很好的描述金針菇根部細(xì)粉提取過(guò)程中多糖提取率隨提取條件的變化規(guī)律，可以用此模型對(duì)多糖的提取率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Design and results of response surface experiments

表3 回歸模型方差分析Table3 Variance analysis of regression equation

由表3可以看出，酶解法輔助提取金針菇根部多糖的工藝參數(shù)中，影響多糖提取率的因素按主次順序排列為酶解溫度（X2）＞酶解時(shí)間（X3）＞酶解pH（X1）。在所選各因素水平范圍內(nèi)，X2、X3、X1X2、X1X3、X、X、X對(duì)Y的影響顯著。由此可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不呈簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，交互項(xiàng)和二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值也有較大的影響作用。

2.3.3 響應(yīng)面分析 根據(jù)回歸方程，固定1個(gè)因素在零水平上，研究另外2個(gè)因素間的交互效應(yīng)，作響應(yīng)曲面圖，分析各影響因素對(duì)多糖提取率的影響以及各因素間的交互效應(yīng)，如圖7（a～c）所示。各圖顯示提取pH、提取溫度和提取時(shí)間中任意1個(gè)變量取零水平時(shí)，其余2個(gè)變量對(duì)多糖提取率的影響。從圖7中可以看出，除圖a中溫度的變化外，其余的均是任意1個(gè)因素取零水平，其余2個(gè)因素同時(shí)變化時(shí)，隨著二者的增加，多糖提取率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。其中，圖7（a）和圖7（b）的曲面較為陡峭，表明酶解pH和酶解溫度、酶解pH和酶解時(shí)間之間均有較強(qiáng)的交互作用。

圖7 兩因素交互影響金針菇根部多糖提取率的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plot showing the effectof every two factors interaction on the yield of polysaccharide

2.3.4 模型的優(yōu)化和驗(yàn)證 通過(guò)Design Expert 7.1.3分析得到木瓜蛋白酶輔助提取灰樹花根部多糖的最佳酶解條件為pH5.48，溫度52.54℃、時(shí)間81.85min，在此條件下多糖提取率的預(yù)測(cè)值為5.925%。為檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否可靠，根據(jù)最優(yōu)條件進(jìn)了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，為方便實(shí)際操作，選取酶解pH為5.5、酶解溫度52℃、酶解時(shí)間82min，在此條件下進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)。將修正后的優(yōu)化條件代入回歸方程，得到多糖的理論提取率為5.93%，而實(shí)際測(cè)得多糖的平均提取率為5.90%，與模型預(yù)測(cè)值基本一致，充分說(shuō)明了該模型能夠較好地模擬和預(yù)測(cè)金針菇根部多糖的酶輔助提取條件與多糖提取率之間的關(guān)系，同時(shí)也說(shuō)明了酶解工藝參數(shù)的可行性。

2.4 多糖的得率和純度

在最優(yōu)酶解工藝參數(shù)下提取金針菇根部多糖，提取液經(jīng)醇沉和干燥后，測(cè)定多糖得率和多糖純度，結(jié)果如表4所示。可見(jiàn)，與傳統(tǒng)的熱水浸提法相比，木瓜蛋白酶輔助提取金針菇根部多糖的多糖得率和多糖純度均極顯著升高，分別達(dá)到9.34%和67.3%；而蛋白質(zhì)含量則極顯著降低。

表4 多糖得率和純度Table4 Obtain rate and purity of polysaccharide

3 結(jié)論

本研究采用木瓜蛋白酶酶解新工藝提取金針菇根部多糖，該工藝通過(guò)酶水解破壞菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有效酶解與多糖結(jié)合在一起的蛋白質(zhì)，將多糖釋放出來(lái)，從而提高多糖提取率，同時(shí)又能降低多糖中蛋白質(zhì)的含量，提高多糖純度。

為優(yōu)化酶解法提取多糖工藝條件，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到影響金針菇根部多糖提取率的工藝因素按主次順序排列為酶解溫度（X2）＞酶解時(shí)間（X3）＞酶解pH（X1）。最終確定最佳提取工藝條件為木瓜蛋白酶添加量1.5%、料液比1∶20、酶解pH為5.5、酶解溫度52℃、酶解時(shí)間82m in，在此最佳條件下，多糖的提取率為5.90%，得率為9.34%，多糖純度為67.3%，蛋白質(zhì)含量為5.3%，均極顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的熱水浸提法。

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