不同菌種比例對發(fā)酵桑葉茶生物活性成分含量的影響

肖 洪，黃先智，丁曉雯，*，沈以紅，張亞瓊，梁菡峪，張 迪，丁順杰

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715；2.西南大學(xué)蠶學(xué)與生物系統(tǒng)研究所，重慶400715；3.家蠶基因組生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715）

桑葉茶（Mulberry-leaf Tea）是由桑葉加工制作而成的新型茶品，目前一般采用直接烘干或自然發(fā)酵的方式生產(chǎn)。桑葉綠茶甘醇香甜；桑葉烏龍茶爽口醇和，有淡淡的花香；桑紅茶甘甜醇厚，有近似香蕉的果香味[1]。但桑葉綠茶普遍存在湯色發(fā)黑，豆腥味重，感官品質(zhì)不佳的問題，為此，人們嘗試開發(fā)桑葉烏龍茶、紅茶等產(chǎn)品。桑葉茶的主要功能成分包括生物堿、茶多酚、花青素、綠原酸、白藜蘆醇、氧化芪三酚、β-胡蘿卜素等生物活性物質(zhì)[2-3]。桑葉茶的礦物元素含量比茶葉高出3～6倍；總糖、酚類物質(zhì)、氨基酸含量都較高；同時桑葉葉面較薄，比茶葉易溶解出更多的有效成分，有利于人體的吸收[4]。脫氧野尻霉素（Deoxynojirimycin，DNJ）是一種極性含N化合物，其化學(xué)名稱為3，4，5-三羥基-2-羥甲基四氫吡啶，分子式為C6H13NO4，相對分子質(zhì)量為163[5-6]，是一種α-葡萄糖苷酶抑制劑，具有降血糖[7-8]、降血脂[9-10]、抗腫瘤[11]、抑制變形鏈球菌生長[12]、抗病毒[13]等功效。桑葉是植物中DNJ含量比較高的，但不同葉位、加工工藝等諸多因素都可能影響到桑葉茶中DNJ的含量[14-15]。黃酮類物質(zhì)是一類天然的抗氧化劑，能夠清除人體中超氧離子、氧自由基、脂質(zhì)過氧化物、過氧化氫及酶類所不能清除的羥自由基等，具有降血壓、抗氧化、防癌，抗炎、抗過敏、利尿、解痙、鎮(zhèn)咳、降血脂等生理作用[16]。桑葉中含有的多糖具有顯著的降血糖作用[17]，可以抑制α-葡萄糖苷酶和豬胰液α-淀粉酶的活性[18]等作用。前期實(shí)驗(yàn)探究了不同菌種單獨(dú)或組合人工接種發(fā)酵對桑葉茶中DNJ、黃酮、多糖、多酚等主要功能成分含量的影響。發(fā)現(xiàn)黑曲霉、日本根酶、綠色木霉復(fù)合發(fā)酵制得的桑葉茶綜合品質(zhì)好，本文以不同黑曲霉、日本根酶、綠色木霉菌種比例發(fā)酵桑葉茶，分析不同菌種比例對發(fā)酵桑葉茶中DNJ、黃酮、多糖、多酚4種功能成分含量變化，為桑葉的深度開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉（AsPergillus niger） GSICC 60108，甘肅省微生物菌種保藏中心；日本根霉（Rhizopus japonicus Vuillem in） GIM 3.119，廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心；綠色木霉（Trichoderma viride）GIM 3.443，廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心（注以上三種菌種的安全等級均高，其生物危害程度為四類，在通常情況下不會引起人類或者動物疾?。?；自然發(fā)酵、人工發(fā)酵桑葉茶 由本實(shí)驗(yàn)室自制；DNJ標(biāo)準(zhǔn)品 北京德威鈉生物技術(shù)有限公司；甘氨酸（Gly）、9-芴基氯甲酸甲酯（FMOC-Cl） Sigma公司；乙腈 色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 北京德威鈉生物技術(shù)有限公司；其他常用試劑 均為分析純。

Waters 1525 HPLC 美國Waters公司；5810型臺式高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Spectrum lab 22可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵桑葉茶的制備 采摘從頂芽往下數(shù)4～10片的新鮮桑葉，去柄，切為4cm×4cm的小葉片，混勻后稱取100g葉片用微波殺青90s，揉捻，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)，設(shè)置黑曲霉∶日本根酶∶綠色木霉為1∶2∶1、2∶1∶2、1∶1∶1、2∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶2六種比例，加入107cfu的不同比例的黑曲霉+日本根酶+綠色木霉菌液10m L（自然發(fā)酵只加10m L無菌水），復(fù)揉，28℃發(fā)酵5h，微波干燥，制得桑葉茶。

1.2.2 DNJ的測定

1.2.2.1 測試樣品的制備 取桑葉茶粉末0.5g，加入一定量超純水，80℃水浴浸提2h（每20min搖勻一次），抽濾后，濾渣再加水浸提2次。合并浸提液，用超純水定容至50m L，即得樣品提取液。

1.2.2.2 DNJ的衍生化及測定方法 按照參考文獻(xiàn)[19]進(jìn)行。色譜條件：色譜柱：C18柱（150mm×4.6mm×5μm）；流動相：乙腈-0.1%醋酸（50∶50，V/V）；流速：1.0m L/min；柱溫25℃；進(jìn)樣量10μL；紫外檢測器，檢測波長254nm。

1.2.3 黃酮測定 取桑葉茶粉末0.5g于50m L離心管中，加70%乙醇15m L，80℃水浴160W功率超聲提取15min，7000r/min離心5min，抽濾，得到濾液。如此共提取3次，濾液用70%的乙醇定容至50m L。吸取1.0m L濾液，用AlCl3比色法[20]測定。

1.2.4 多糖測定 取桑葉茶粉末0.250g于蘭蓋瓶中，加入20m L沸蒸餾水，在200W功率下55℃超聲提取20m in，將提取液過濾后定容至25m L。取1.0m L濾液用苯酚-硫酸法[21]測定多糖含量。

1.2.5 多酚測定 按照GB/T 8313-2008茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法[22]進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

各實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次以上，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel和SPSS 16進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 各活性成分標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

按照1.2.2的實(shí)驗(yàn)方法，對不同濃度DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，得到DNJ的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y= 15776x-70392，相關(guān)系數(shù)r=0.9996。式中x為DNJ濃度，μg/m L；y為峰面積。

按照1.2.3實(shí)驗(yàn)方法，測定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y= 11.622x-0.0031，相關(guān)系數(shù)r=0.9997。式中，x為蘆丁濃度，μg/m L；y為吸光度。

按照1.2.4的實(shí)驗(yàn)方法，測定不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，得到葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=10.909x-0.0021，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。式中，x為葡糖糖的濃度，μg/m L；y為吸光度。

按照1.2.5的實(shí)驗(yàn)方法，測定不同濃度沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，得到?jīng)]食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.0208x+0.0034，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。式中，x為沒食子酸的濃度，μg/m L；y為吸光度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.9990，線性關(guān)系良好，可用于樣品中相關(guān)活性成分的測定。

2.2 DNJ標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖

將DNJ經(jīng)衍生化后上高效液相色譜儀進(jìn)行測定，得到如圖1～圖3所示的色譜圖。

圖1 空白色譜圖Fig.1 Chromatogram of blank sample

圖2 DNJ標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 Chromatogram of DNJstandard

圖3 桑葉茶樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram ofmulberry-leaf tea sample

由色譜圖2可知，在本實(shí)驗(yàn)條件下，DNJ衍生物DNJ-FMOC的保留時間為2.731m in，與Gly-FMOC和FMOC-OH的峰間距分別相差2.719min和4.243min，表明這兩種物質(zhì)均不干擾DNJ的測定。

2.3 不同菌種比例對發(fā)酵桑葉茶中DNJ含量影響

分別在不同比例下加入107cfu黑曲霉+日本根霉+綠色木霉菌液10m L，在28℃發(fā)酵5h生產(chǎn)桑葉茶，探究其DNJ含量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，與自然發(fā)酵比較，所有菌種比例發(fā)酵后DNJ含量均增加，其中黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為1∶2∶1、2∶1∶2、1∶1∶1、2∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶2發(fā)酵的桑葉茶中DNJ含量分別為147.8、151.3、148.4、145.7、142.5、 149.7mg/100g干重，比自然發(fā)酵分別增加了6.43%、8.94%、6.85%、4.93%、2.61%、7.82%，與自然發(fā)酵比較，以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為1∶2∶1、2∶1∶1、1∶1∶2發(fā)酵的桑葉茶中DNJ含量無顯著性差異（p＞0.05）；而以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為2∶1∶2、1∶1∶1、1∶2∶2發(fā)酵后的桑葉茶中DNJ含量有顯著性差異（p＜0.05），特別是黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為2∶1∶2發(fā)酵后的桑葉茶中DNJ含量最高達(dá)151.3mg/100g干重，這可能是黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為2∶1∶2時更利于這3種菌種相互協(xié)同作用，利用桑葉茶中的營養(yǎng)物質(zhì)從而產(chǎn)生DNJ。

圖4 不同發(fā)酵比例對發(fā)酵桑葉茶中DNJ含量影響Fig.4 The contentof DNJofmulberry-leaf tea by different fermentation strains rate

2.4 不同菌種比例對發(fā)酵桑葉茶中黃酮含量影響

分別在不同比例的下加入107cfu黑曲霉+日本根霉+綠色木霉菌液10m L在28℃發(fā)酵5h生產(chǎn)桑葉茶，探究其黃酮含量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同發(fā)酵比例對發(fā)酵桑葉茶中黃酮含量影響Fig.5 The contentof flavonoid ofmulberry-leaf tea by different fermentation strains rate

由圖5可知，與自然發(fā)酵比較，其中以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為1∶2∶1時黃酮含量為4.22g/100g干重，增加了1.16%，無顯著性差異（p＞0.05）。以2∶1∶2、1∶1∶1、2∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶2比例發(fā)酵的桑葉茶中黃酮含量均降低，以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉=1∶1∶2發(fā)酵的桑葉茶中黃酮含量為3.99g/100g干重，僅降低了4.24%，無顯著性差異（p＞0.05）；而以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為2∶1∶2發(fā)酵桑葉茶中黃酮含量降低了8.98%，有顯著性差異（p＜0.05）；以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為1∶1∶1、2∶1∶1、1∶2∶2發(fā)酵的桑葉茶中黃酮含量分別為3.53、3.71、3.76g/100g干重，與自然發(fā)酵比較分別降低了15.39%、10.98%、9.73%，均具有極顯著差異（p＜0.01）?？赡苁怯捎诤谇?、日本根霉、綠色木霉3種菌相互作用，當(dāng)在黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為1∶2∶1時利于桑葉茶中黃酮的產(chǎn)生，而其他5種比例時不利于黃酮的產(chǎn)生，反而要利用和分解桑葉茶中的黃酮，或有可能生成了其他有色物質(zhì)。

2.5 不同菌種比例對發(fā)酵桑葉茶中多糖含量影響

分別在不同比例的下加入107cfu黑曲霉+日本根霉+綠色木霉菌液10m L在28℃發(fā)酵5h生產(chǎn)桑葉茶，探究其多糖含量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同發(fā)酵比例對發(fā)酵桑葉茶中多糖含量影響Fig.6 The contentof polysaccharid ofmulberry-leaf tea by different fermentation strains rate

由圖6可知，與自然發(fā)酵比較，其中以各比例的黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉發(fā)酵的桑葉茶中多糖含量均降低，其中以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉=1∶2∶1發(fā)酵的桑葉茶中多糖含量為12.15g/100g干重，降低了6.78%，無顯著性差異（p＞0.05）；以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為1∶1∶1、2∶1∶1、1∶1∶2發(fā)酵的桑葉茶中多糖含量分別為11.85、11.99、11.78g/100g干重，分別降低了9.12%、8.01%、9.64%，與自然發(fā)酵比較具有顯著性差異（p＜0.05）；而以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為2∶1∶2、1∶2∶2發(fā)酵的桑葉茶中多糖含量分別為11.30、11.68g/100g干重，與自然發(fā)酵比較分別降低了13.30%、10.43%，具有極顯著差異（p＜0.01）。這可能是因?yàn)椴煌N比例的黑曲霉、日本根霉、綠色木霉相互作用后，分解利用了桑葉茶中的多糖，從而利于桑葉茶中其他活性成分的形成。

2.6 不同菌種比例對發(fā)酵桑葉茶中茶多酚含量影響

分別在不同比例的下加入107cfu黑曲霉+日本根霉+綠色木霉菌液10m L在28℃發(fā)酵5h生產(chǎn)桑葉茶，探究其多酚含量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，與自然發(fā)酵比較，以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉=1∶2∶1發(fā)酵的桑葉茶中多酚含量為0.66g/100g干重，多酚含量僅增加了1.68%，無顯著性差異（p＞0.05）；其余所有比例發(fā)酵的桑葉茶中多酚含量均降低，其中黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉=2∶1∶2發(fā)酵的桑葉茶中多酚含量為0.61g/100g干重，多酚含量下降了6.26%，與自然發(fā)酵比較有顯著性差異（p＜0.05）；而以黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉為1∶1∶1、2∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶2發(fā)酵的桑葉茶中多酚含量分別為0.54、0.58、0.57、0.49g/100g干重，與自然發(fā)酵比較分別下降了16.04%、9.76%、12.60%、23.90%，具有極顯著性差異（p＜0.01）?？赡苁前l(fā)酵過程中黑曲霉、日本根霉、綠色木霉3種菌相互作用，當(dāng)比例為1∶2∶1時利于桑葉茶中多酚的形成，而其他5種比例時桑葉茶中的大量多酚類化合物被氧化聚合成有色物質(zhì)。

3 結(jié)論

通過上述研究結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉=1∶2∶1發(fā)酵的桑葉茶中DNJ增加6.43%，黃酮增加1.16%，多糖降低6.78%，多酚增加1.68%，綜合品質(zhì)好。而用黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉=2∶1∶2發(fā)酵的桑葉茶中DNJ增加8.94%，為最高，其中DNJ是桑葉茶中最主要的功能性成分。因此，認(rèn)為黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉=2∶1∶2是在所用的實(shí)驗(yàn)菌種比例中保證發(fā)酵桑葉茶功能性質(zhì)最好的菌種。

[1]王忠華，吳月燕，張燕忠.不同加工工藝制成桑葉茶的感觀品質(zhì)及營養(yǎng)活性成分分析[J].蠶業(yè)科學(xué)，2011，37（2）：272-277.

[2]KIM D C，IN M J，CHAE H J.Preparation of Mulberry Leaves Tea and Its Quality Characteristics[J].Journal of Applied Biological Chemistry，2010，53（1）：56-59.

[3]SONGWEI，WANGHanjing，BUCHELIP，etal.Phytochemical profiles of differentmulberry（Morus sp.）species from China[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（19）：9133-9140.

[4]李旭玫，傅水玉.桑葉茶中營養(yǎng)成分的測定與研究[J].杭州師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，5（1）：58-60.

[5]KOJID，YOSHIHIKO I，TSUNEMATSU T.Studies on the constituents of the water extract of the root of mulberry tree（Morus bombycis Koidz）[J].Chem Pharm Bull，1986，34（5）：2243-2246.

[6]MARUO S，YAMASHITA H，MIYAZAKIK，et al.A novel and efficient method for enzymatic synthes is of high purity maltose usingmoranoline（1-deoxynojirimyein）[J].Bios Biotechnol Biochem，1992，56（9）：1406-1409.

[7]CHALUNTORN V，KIYOTAKA N，PHUMON S，et al.Developmentof high 1-deoxynojirimycin（DNJ）contentmulberry tea and use of response surface methodology to optimize teamaking conditions for highest DNJ extraction[J].Food Science and Technology，2012，45（2）：226-232.

[8]KIMURA T，NAKAGAWA K，KUBOTA H，et al.Food-grade mulberry powder enriched with 1-deoxynojirimycin suppresses the elevation of postprandial blood glucose in humans[J].Journalof Agricultural and Food Chemistry，2007，55（14）：5869-5874.

[9]KOJIMA Y，KIMURA T，NAKAGAWA K，et al.Effects of mulberry leaf extract rich in 1-deoxynojirimycin on blood lipid profiles in Hhumans[J].Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition，2010，47（2）：155-161.

[10]TSUDUKI T，NAKAMURA Y，HONMA T，et al.Intake of 1-deoxynojirimycin suppresses lipid accumulation through activation of the beta-oxidation system in rat liver[J].Journal of Agriculture and Food Chemistry，2009，57（22）：11024-11029.

[11]WANG R J，YANG C H，HU M L.1-deoxynojirimycin inhibitsmetastasis of B16F10 melanoma cells by attenuating the activity and expression of matrix metalloproteinases-2 and-9 and altering cell surface glycosylation[J].Journal of Agriculture and Food Chemistry，2010，58（16）：8988-8993.

[12]ISLAM B，KHAN SN，HAQUE I，etal.Novelanti-adherence activity of mulberry leaves：inhibition of Streptococcus mutans biofilm by 1-deoxynojirimycin isolated from Morus alba[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2008，62（4）：751-757.

[13]JACOB J R，MANSFIELD K，YOU J E，et al.Natural iminosugar derivatives of1-deoxynojirimycin inhibitglycosylation of hepatitis viral envelope proteins[J].Journal of Microbiology，2007，45（3）：431-440.

[14]楊清，徐立，王俊，等.桑紅茶發(fā)酵工藝條件優(yōu)化及活性成分含量的動力學(xué)研究[J].蠶業(yè)科學(xué)，2010，36（2）：221-228.

[15]孫國霞，王俊，龔敏，等.不同葉位桑葉及發(fā)酵溫度對桑紅茶中活性成分含量的影響[J].蠶業(yè)科學(xué)2011，37（6）：1061-1066.

[16]王芳，勵建榮.桑葉的化學(xué)成分、生理功能及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2005，26（S）：111-117.

[17]薛長勇，騰俊英，邱繼紅，等.桑葉多糖～肽復(fù)合物的降血糖、血脂作用[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2005，27（2）：167-168.

[18]寇秀穎，杜陽吉，徐勇.桑葉黃酮類和多糖類化合物的提取及其降血糖作用研究[J].食品工程，2010（4）：39-41

[19]耿鵬，朱元元，楊洋，等.桑樹資源中1-脫氧野尻霉素的測定及其生物活性分析[J].中草藥，2005，36（8）：1151-1154.

[20]李旭玫.桑葉茶元素分析及其保健功能分析[J].浙江林業(yè)科技，2005，25（3）：31-33.

[21]李旭玫，傅水玉.桑葉茶中營養(yǎng)成分的測定與研究[J].杭州師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，5（1）：58-60.

[22]中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 8313-2008茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.